外源性MGF对骨骼肌卫星细胞迁移的影响及其机制的研究

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研究目的骨骼肌发生损伤之后,处于静息状态下的肌卫星细胞在生长因子和肌纤维释放信号的作用下被激活,被激活的肌卫星细胞会迁移到受损部位,通过增殖、分化等细胞行为,形成新的肌管与肌纤维融合,从而修复受损的骨骼肌。以往的研究重点放在MGF对肌卫星细胞的激活、增殖和分化方面,但是关于MGF对肌卫星细胞的迁移影响的研究并不多见,以及MGF发生其生物学功能的机制还没完全弄清楚。本研究在骨骼肌卫星细胞离体培养的基础上,用人工合成的MGF进行实验干预,同时使用k1030(PI3K/Akt抑制剂)和k1022(MAPK/MEK抑制剂),探究MGF对肌卫星细胞迁移的影响及其信号传导通路的机制。实验方法选用3-4周雄性SD大鼠,无菌条件下提取大鼠双侧后肢的腓肠肌、比目鱼肌以及背部肌肉;在超净工作台上用II型胶原酶和胰酶逐步消化剪碎的肌组织来释放肌卫星细胞;采用两次差速贴壁法来纯化肌卫星细胞。用台酚蓝染色检测肌卫星细胞的活性率;通过横纹肌肌动蛋白染色来鉴定肌卫星细胞的纯度。选用传代在5代之内的肌卫星细胞来进行干预,实验分成三组:Control组(C组)、k1030组、k1022组,每组分别设置0ng/ml、25ng/ml、35ng/ml、45ng/ml浓度的MGF对肌卫星细胞进行处理,在干预12小时后,用Transwell法检测肌卫星细胞的迁移率;利用Western Blot检测各个实验组中Akt和Erk1/2蛋白的表达。实验结果1、台酚蓝染色结果:本次试验共计数523个细胞,着色细胞为23个,肌卫星细胞活性率为500÷523=95.6%,符合实验要求。2、横纹肌肌动蛋白染色结果:横纹肌肌动蛋白在染色细胞上着色呈棕褐色,呈阳性表达,显示被染色的细胞是肌卫星细胞。3、Transwell结果:(1)C组实验数据表明,25、35、45ng/ml MGF组的Transwell法检测后的肌卫星细胞的OD值显著性高于0ng/ml MGF组。(2)k1030组的0、25、35、45ng/mlMGF组的Transwell法检测后的肌卫星细胞的OD值呈显著低于C组相应浓度的MGF组;k1022组的25ng/ml MGF组显著性低于C组25ng/ml MGF组,其他MGF组虽然低于C组相应浓度MGF组,但无统计学意义。4、Western Blot结果:(1)C组实验数据表明,25、35、45ng/ml MGF组的Akt、磷酸化的Akt表达显著性高于0ng/ml MGF,但Akt的磷酸化率却显著性低于0ng/ml MGF组;同时Erk1/2、磷酸化的Erk1/2和Erk1/2的磷酸化率都显著高于0ng/ml MGF组。(2)k1030组的0、25、35、45ng/ml MGF组的Akt、磷酸化的Akt表达都显著性低于C组;k1030组的0、25ng/ml MGF组的条件Akt磷酸化率显著性低于C组相应浓度MGF组。k1022组的0、25、35、45ng/ml MGF组的Erk1/2、磷酸化的Erk1/2表达和Erk1/2磷酸化率都显著性低于C组对于浓度MGF组。结论1:外源性MGF能够促进肌卫星细胞的迁移,在0-45ng/ml范围内,促进细胞迁移效果随着MGF的浓度增加呈逐渐上升趋势。2:外源性MGF促进肌卫星细胞迁移的作用可能主要通过PI3K/Akt信号传导通路实现;MAPK/MEK信号通路对肌卫星细胞细胞的迁移可能也有影响。
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