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新型冠状病毒肺炎（Coronavirus disease 2019,COVID-19）是当前世界上最具危害的传染性疾病之一,截止到2022年4月5日,已造成全球约6.39%的人感染,并且感染人数仍然在迅速增长。诊断与隔离作为疫情防控的第一步,也是最有效的一步。基因组测序是COVID-19最准确的诊断方式,但是其对实验室安全等级、设备以及操作人员较高的技术要求限制了其在临床检测中的应用。抗原、抗体检测可以在30min内给出结果,然而其检测窗口期长,只有在患者体内病毒含量足够高时,才能正确检出。逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测相比恒温扩增（Isothermal amplification technologies,IAT）检测,通量更大,成本更低,技术更成熟,已成为诊断COVID-19的金标准。但是RT-PCR检测技术在实践中存在一些问题:感染早期患者体内病毒含量低,核酸提取样本利用率低,导致检测灵敏度达不到预期水平;新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）基因组突变可能造成核酸检测假阴性结果;当前核酸检测耗时较长,无法提供即时检测结果,迫切需要提高检测效率。本论文分析了 SARS-CoV-2核酸检测的体系和流程,对现有检测技术进行改进,达到了更加准确且快速的检测目标。主要研究内容如下:（1）定量分析SARS-CoV-2核酸检测过程中的灵敏度损失,为优化检测流程、解决假阴性问题提供支持。本论文对SARS-CoV-2样本保存液pH值、保存液体积、核酸提取方法及样本利用率等可能影响诊断灵敏度的因素进行系统地定量分析,并提出避免灵敏度损失的检测方案。结果显示:使用酸性样本保存液,采用离心柱法提取核酸可最大限度地避免检测灵敏度损失;对于单人份样本,随着保存液体积增大,假病毒释放更充分,当保存液体积达到3 mL时,假病毒接近完全洗脱;优化的检测方案（全部保存液用离心柱法提取核酸且PCR体系中加入12 μL模板）与常规检测方案（取200 μL保存液用磁珠法提取核酸且PCR体系中加入4 μL模板）相比,检测灵敏度提高10倍。（2）探究混合检测在COVID-19诊断中的应用,设计新型大体积样本核酸提取方法,为大规模核酸筛查提供更快捷有效的检测方案。本论文对SARS-CoV-2混合检测进行研究并设计了一种利用注射器纯化柱进行大体积样本核酸提取方法。Ct值在30左右的阳性样本按照国务院颁布的稀释混样检测技术指引,在10人份混检时Ct值变大3左右;按照国务院颁布的混采检测技术指引,在10人份混检时Ct值会变大1左右。使用本研究设计的方法将混合样本的全部保存液进行核酸提取,不论采用稀释混样检测还是混采检测,当混样比例达到1:29时,与阳性样本“单采单检”相比,检出的Ct值都不会增大,即检出率不会降低,避免了假阴性现象的发生。（3）综合靶标基因所编码的蛋白质三维结构和遗传密码规律提出一种创新的引物设计策略,降低了由于SARS-CoV-2基因组突变导致的核酸检测假阴性风险。本论文分析了靶标序列与引物或探针的错配对PCR检测的影响,证明了引物3’端的错配对PCR反应影响最大,而其它位置的错配并不会显著影响PCR检测。这暗示将引物3’端置于SARS-CoV-2突变致死的氨基酸编码核苷酸上,可以降低由于SARS-CoV-2基因组突变造成的PCR检测失败的风险。色氨酸是一个特殊的氨基酸,它只有一个编码密码子,同时它也是最大的氨基酸,具有特殊侧链,对蛋白质结构核的稳定起重要作用,发生在色氨酸密码子上的突变往往对蛋白质的活性产生影响。基于以上分析,本论文设计了两对靶向N基因的检测引物NAm1（N anti-mutation 1,NAm1）和NAm2（N anti-mutation2,NAm2）。结果显示:两对引物的3’端,4个氨基酸的单碱基突变体蛋白结构域的热稳定性显著下降,尤其是色氨酸的突变体蛋白结构域,其热变性温度低于正常人体的体温37℃。37℃诱导表达时,突变体蛋白的产量下降明显,这意味着该位点发生突变的病毒在人体中难以存活,因此实际上在人群中不会存在。同时性能验证结果表明NAm1和NAm2引物对检测重复性优异,且与中国和美国疾病预防控制中心设计的检测引物具有相同的特异性和灵敏度。（4）设计优化快速RT-PCR检测体系,缩短了 SARS-CoV-2核酸检测时长。当前核酸检测试剂盒均采用两步法,将聚合酶的延伸温度降至引物的退火温度（55-60℃）,这导致了聚合酶扩增速率低下,检测时间过长。本论文对引物和探针进行延长优化,使其退火温度满足Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度（70-74℃）,保证了 Taq DNA聚合酶的最快延伸速率。通过使用FQS探针（5’端标记荧光基团,距离5’端较近的碱基T标记淬灭基团,3’端用Spacer C3封闭）消除了由于探针的延长导致的淬灭效率的下降,降低了反应体系的背景荧光。检测结果表明使用该引物对可将PCR反应中退火和延伸步骤由常规的20-40s缩短至13 s。此外本论文优化了 PCR反应中其他环节的时间,在保证检测性能不下降的前提下,将整个核酸检测时长由74 min缩短至37 min。综上所述,本论文针对SARS-CoV-2核酸检测技术进行研究与改进。最终设计了降低灵敏度损失的检测方案以及一种大体积样本核酸纯化方法用于提高混检效率,提出了一种新型引物设计策略降低了由于SARS-CoV-2基因组突变造成的核酸检测假阴性风险。在此基础上,对RT-PCR反应中的引物和探针进行优化,将核酸检测时长缩短至常规方法的50%。