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当前,外源蛋白表达形成的包涵体对于生物活性物质的生产以及结构和功能的研究产生了巨大的阻碍作用,尤其是在大肠杆菌中的表达更引起了人们的重视。为了解决这个问题,将麦芽糖结合蛋白(MBP)、小分子泛素样修饰蛋白(SuMO)、细菌翻译起始因子(IF2)、氮源利用物质A(NusA)以及谷胱甘肽转移酶(GST)等融合标签与目的蛋白质共表达,可以提高目的蛋白质的可溶性表达量。并且现在,利用固相金属亲和层析来纯化带有组氨酸标签的目的蛋白质是一种非常有效的蛋白纯化技术,并且被许多实验室利用。然而,考虑到蛋白标签对靶蛋白的结构与功能的影响,不得不将靶蛋白从融合标签中分离出来得到天然的活性蛋白质。具有代表性的方法是利用TEV蛋白水解酶切割融合蛋白的蛋白水解酶切位点得到靶蛋白,最终通过亲和层析获得纯化的靶蛋白。然而在许多情况下,细胞内切割融合蛋白是非常重要的,不仅能节约时间还能优化实验过程,蛋白水解酶和融合蛋白细胞内共表达能在蛋白质纯化之前将融合标签与靶蛋白分开,实现细胞内的自剪切。本研究将Beta融合标签分别与GFP、hRnBP、Slr1975目的蛋白融合表达,得出Beta能提高GFP蛋白可溶性表达量；Beta能促进hRnBP和slrl975蛋白可溶性增加,约增加了70%,但表达量变化不大。根据以上实验结果利用镍柱亲和层析方法纯化融合蛋白His-Beta-GFP、His-Beta-hRnBP、His-Beta-Slrl975。最后的纯化效果不是很好,目的条带不单一。本研究将MBP融合标签分别与GFP和N-TIMP基因融合得到重组克隆pLS3012和pLS3011。分别转入表达TEV蛋白酶的菌株LS2416,完成细胞内的自剪切,最后利用镍柱亲和层析方法纯化目的蛋白。SDS-PAGE图显示TEV酶的切割效率很高,几乎为100%。利用His标签亲和层析纯化后获得了单一的GFP和N-TIMP蛋白条带。本研究分别在基因组和质粒水平探究了Neu5Ac的全细胞酶催化效率,并利用TBA法和HPLC法测定了其产量,结果显示质粒水平比基因组水平全细胞酶催化的摩尔转化率高,转化率分别是41.3%和37.5%,与之前的双酶偶联相比较转化率虽然有所降低,但是实现了BT0453和nanA在质粒水平和基因组水平的共表达,缩短了两个酶空间上的距离,提高了中间物ManNAc的利用率,节省了时间,促进了经济效益。并且基因组水平的酶表达还克服了质粒表达不稳定、容易丢失等缺点。本研究为了提高Neu5Ac的产量,在LS2402 (BT0453和nanA在基因组上共表达)基础上,通过重组工程和Ⅰ-SceI双链断裂修复技术敲除氯霉素基因cat,因为此基因的表达影响了Neu5Ac醛缩酶和异构酶的表达。根据SDS-PAGE图显示cat基因最终没有表达,得到正确菌株,命名为LS2802。,为了进一步提高Neu5Ac产量,本研究成功构建了表达质粒pLS2812和pLS2814,它们分别包含葡萄糖-6-P-N-乙酰基转移酶(ScGNA1)基因和氨基葡萄糖合成酶(glmS*72)基因,后续将这两个基因敲入LS2802基因组来提高N-乙酰-D-神经氨酸产量。