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丝羽乌骨鸡是我国独特的家禽品种,以其特有的外貌特征、药用性能和营养价值被研究者所重视。丝羽乌骨鸡外观呈乌色、乌肉,乌骨的特征,肌肉品质好,皮薄肉细,营养丰富,但是生长缓慢,产肉性能较低,引起黑色素沉积的调控机制不清。基因及表达的差异是导致生物性状多样性的根本原因,乌骨鸡与其他鸡种相比所表现的各种独特性状必定也是由基因及其表达的差异所引起。差异显示逆转录PCR(DDRT-PCR)是一种比较两组或多组样品中基因表达差异的技术。利用DDRT-PCR,我们比较了初生丝羽乌骨鸡(SK)、常羽乌骨鸡(NP),爱拨益加(AA)肉鸡和尼克(NK)蛋鸡腿肌组织的基因表达的差异,从而为我们从分子水平了解乌骨鸡腿肌在初生阶段特异性状的形成提供重要信息。 本实验采用3个26bp的T7(dT11)N为锚定引物,24个26bp的M13-ARPs为随机引物,组成72个引物组合对上述四个品种雏鸡腿肌组织进行DDRT-PCR反应。采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染方法分离差异片段,共获得214个差异片段,经重扩增和纯化后得到101个条带。利用单链构象多态性(SSCP)技术验证差异显示片段重扩增纯化产物的单一性,共得到87条单一片段。通过基因芯片杂交技术对获得的差异显示cDNA片段真实性进行鉴定,得到6条真实表达的差异条带,仅5条测序成功。 通过NCBI的Blastn检索发现:表达序列标签D1与家鸡的线粒体上细胞色素氧化酶Ⅲ(Gallus gallus cytochrome C oxidase subunit Ⅲ)基因同源;表达序列标签D5与家鸡的肌肉肌酸激酶基因(M-CK)基因同源。利用NCBI的电子PCR(e-PCR),找到它所在的UniSTS,将M-CK基因定位于32号染色体上。对未知功能的ESTs,通过Blast,电子延伸和电子定位得到以下信息:表达序列标签D2与会鱼线粒体的假设18K蛋白(hypothetical 18K protein-goldfish mitochondrion)相似性最高;表达序列标签D3拼接的同源重叠群contig2长1272bp,正向第一阅读框(frame=+1)编码的蛋白质与家鸡的预测HIPK蛋白相似性最高:表达序列标签D4与同源重叠群contig2937相似性最高,正向第三阅读框(Frame=+3)编码蛋白质与家鸡相似的14-3-3e蛋白(epsilon isoform of 14-3-3 protein)序列完全一致。14-3-3e基因定位于家鸡的19号染色体,有少部分序列在定位在9号染色体上。 分析与表达序列标签同源的已知功能的差异表达基因表明:已知功能的差异表达基因可能与初生雏鸡腿肌的生长发育、分化以及色素沉积有一定关系。COⅩⅢ基因在丝羽乌骨鸡和尼克蛋鸡中特异表达,而在山地乌骨鸡和AA肉鸡未表达,暗示COⅩⅢ基因的差异表达与腿肌在初生阶段的生长发育中有关。M-CK基因在AA肉鸡中特异表达,而在其余三种鸡中不表达,推测M-CK基因在促进初生雏鸡腿肌的发育和分化中起着重要调控作用。14-3-3e基因在SK中不表达,在NP、AA肉鸡、