论文部分内容阅读
对氧磷脂酶(Paraoxonase，PON)在血清中主要和高密度脂蛋白(HDL)中的载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)紧密结合，以低密度脂蛋白(LDL)颗粒上的磷脂作为生理反应底物，阻上LDL氧化。近年来许多研究表明：血清对氧磷脂酶(Paraoxonase 1，PON1)与动脉粥样硬化、冠心病、Ⅱ糖尿病发病密切相关，从而影响人类的寿命。本课题将PON1基因作为母猪利用年限性状相关的一个重要侯选基因进行研究，以比较基因组学和生物信息学为理论基础，采用电子克隆、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、cDNA末端快速扩增(RACE)、细菌人工染色体(BAC)文库、辐射杂交(IMpRH)平板、PCR-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)分析等分子生物学技术对猪PON1基因全长cDNA芋列、基因组结构、系统进化树、染色体定位、组织特异性表达及单核苷酸多态性(SNP)进行了分析。主要研究结果如下：
1、利用RT-PCR及RACE技术，首次获得猪PON1基因全长1416 bp cDNA序列，该序列包括85bp 5’非翻译(UTR)区，1068 bp开放阅读框(ORF)，263 bp 3’UTR区，编码355个氨基酸，GenBank登录号：EF473651。
2、将猪PON1基因mRNA序列与其他哺乳动物mRNA序列进行同源比对发现：该基因与人(GenBankNM000446)的同源性为87％，与牛(GenBankNM001046269)的同源性为87％，与大熊猫(GenBank XM519211)的同源性为86％，与大鼠(GenBankNM032077)的同源性为81％，与小鼠(GenBank NM011134)的同源性为80％；其推导的氨基酸序列与人、牛、熊猫、大鼠、小鼠的氨基酸序列同源性分别为84％、82％、84％、78％和78％。
3、通过BAC文库筛查，首次获得猪PON1基因完整的基因组序列，该序列大小约为28947 bp，包含9个外显子和8个内含子，所有外显子和内含子的交界均遵循GT-AG规则，GenBank登录号：EU221257。
4、应用IMpRH杂交平板，首次把猪PON1基因定位到9号染色体上，位于微卫星标记SWR915与SW944之间，与SWR915标记紧密连锁，LOD值为11.72。
5、通过RT-PCR方法对PON1基因在蓝塘猪和大约克夏猪12个组织中的mRNA表达水平进行了初步研究，发现猪PON1基因在肝脏和肾脏中高度表达，在肺脏中微弱表达，在心脏、脾脏、胃、背肌、脂肪、大脑、小脑、下丘脑、小肠等组织中不表达。
6、采用DNA池结合测序技术对猪PON1基因基因组序列进行单核苷酸多态性位点筛查，共发现10个SNPs，其中2个位于编码区，8个位于非编码区，位于编码区的2个SNPs均为同义突变。
7、采用PCR-RFLP方法对猪PONl基因20742 C>T多态位点进行分析发现，中国地方猪种等位基因C的频率明显高于外来猪种，而外来猪种等位基因T的频率明显高于中国地方猪种，推测20742 C>T多态位点可能是影响母猪利用年限性状的分子标记。