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桑枝是蚕桑产业的副产物,利用不够充分。嘉陵20号是西南地区广泛种植的人工三倍体桑树品种,本文对其枝条中的小分子化合物与多糖进行了活性筛选与鉴定,阐释了部分活性成分的作用机理,为其开发利用奠定了基础。具体开展了七个方面工作:(1)为较为全面了解小分子的组成,用UPLC-MS/MS对桑枝提取物进行了分析,并评价了其抗氧化、抑制阿尔兹海默症、降血糖及保护心血管的潜力。结果表明,提取物中主要有生物碱、黄酮等42个化学成分;其对ABTS及DPPH自由基的IC50值分别为8.88±0.36μg/m L与31.23±0.57μg/m L(阳性VC分别为8.79±0.41μg/m L及4.41±0.19μg/m L);抑制α-葡萄糖苷酶(AG)的IC50值为1.90±0.05μg/m L(阳性阿卡波糖为0.03μg/m L);抑制丁酰胆碱酯酶(BCh E)及乙酰胆碱酯酶(ACh E)的IC50值分别为101.82±3.37μg/m L及179.47±0.38μg/m L(阳性小檗碱为57.41±0.21μg/m L及1.27±0.03μg/m L);在10μg/m L及40μg/m L浓度下能显著提高ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的存活率,并显著降低细胞内的活性氧水平。(2)为了确定提取物潜在抗阿尔兹海默症的物质基础,合成了磁性纳米颗粒Fe3O4@BCh E,结合HPLC-SPE-HRMS-NMR技术,快速准确地筛选与鉴定了提取物中的BCh E抑制剂,并对抑制剂进行了活性与分子对接研究。通过研究,分离鉴定出了3个潜在抑制剂kuwanon H、kuwanon G及morusin,其IC50值分别为10.91±0.39μM、70.96±2.62μM及78.65±2.61μM,(阳性galanthamine为60.35±6.88μM)。分子对接表明kuwanon H主要通过氢键与BCh E蛋白中的Asp70、Ser72、Thr284、Leu286及Ser287氨基酸残基产生相互作用,并通过水分子桥键与Pro285产生氢键相互作用,从而发挥抑制活性。(3)为了确定桑枝提取物中潜在抗糖尿病的物质基础,合成了磁性纳米颗粒Fe3O4@Si O2@AG,并与UPLC-MS/MS联用,对提取物中的非生物碱α-葡萄糖苷酶抑制剂进行了快速筛选与鉴定。通过研究,从嘉陵20桑枝提取物中筛选得到了4个抑制α-葡萄糖苷酶活性成分:kuwanon H、kuwanon G、kuwanon C及morusin。其中kuwanon H及kuwanon G抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值分别为2.82±0.68μM及2.83±0.31μM,活性强于阳性DNJ(IC50值为7.04±0.82μM)。同时,分子对接结果表明kuwanon G通过氢键与靶蛋白上的Asp242,Ser311及Glu411残基产生相互作用;kuwanon H除了与Thr310,Glu411,Asn415残基形成氢键作用外,同时其咪唑环还与Hip280残基形成了cation-π;DNJ与Hip7,Pro8及Glu11残基形成氢键作用,三个化合物与酶的作用位点不同。(4)为了确定提取物中潜在的抗动脉粥样硬化物质基础,采用活细胞萃取法结合HPLC-MS分析,快速筛选鉴定了桑枝中保护ox-LDL诱导的HUVECs损伤的目标活性成分,并对目标物质的活性及作用机制进行了研究。结果表明,桑枝中的kuwanon G、kuwanon H及morusin不仅能够被细胞所捕获,且在ox-LDL组中的含量明显降低,显示其可能为潜在的活性成分。三个化合物在20μM浓度下均具有较好的细胞保护活性,其中kuwanon H活性最好。Western blot及RT-q PCR显示,kuwanon H可能通过上调Nrf-2,激活下游抗氧化基因HO-1及NQO-1的表达,进而增强细胞SOD的产生,减少MDA及ROS生成,从而保护ox-LDL诱导HUVECs的损伤。RNAi显示当Nrf-2的表达被抑制后,kuwanon H的作用效果消失。以上结果为桑枝提取物及该类异戊烯基黄酮类化合物在心血管疾病中的应用提供了理论支撑。(5)为了确定其主要活性分段,采用乙醇将嘉陵20号桑枝多糖分级沉淀成三个组分(MBP30、MBP60及MBP90),并对其理化性质、清除自由基与降血糖活性进行了评价。结果显示,随着乙醇浓度升高,所沉淀各组分的总糖、总蛋白与总多酚含量,以及外观形貌差异明显,分子量逐渐减小;但其官能团构成相似,单糖组成相同(均由葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖及甘露糖等组成),但各单糖相对比例存在一定差异,MBPs的葡萄糖占比最高。MBPs各组分均具有很好的清除DPPH、ABTS、OH自由基、抑制α-葡萄糖苷酶及保护H2O2诱导Caco-2细胞损伤的活性,其活性强弱为MBP90>MBP60>MBP30。研究结果为后续活性多糖的分离纯化、结构鉴定等奠定了基础。(6)为了揭示MBP90中降血糖与清除自由基的主要活性物质,在活性指导下,对桑枝抑制α-葡萄糖苷酶与清除DPPH自由基活性的糖类分别进行了柱层析分离与结构鉴定,并对具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的多糖进行了动物水平的活性评价。其中,Fr1-2部分抑制α-葡萄糖苷酶活性最好,其主要为分子量较小的DNJ、fagomine等氨基糖类,其中以葡萄糖苷(92.5%)为主,含有少量半乳糖苷(6.4%),该类化合物可以降低HFD/STZ联合诱导T2DM小鼠的血脂水平、空腹血糖浓度,保护其肝功能;Fr3中的MBP-1具有较好的清除自由基活性,其多糖组成中糖醛酸含量高达65.6%(可能是其主要活性相关因素),最主要的残基为α-1,4-Galp A。(7)采用Sephadex G-100对桑枝中的葡聚糖进行了分离纯化,采用多种手段对其进行结构鉴定,并利用巨噬细胞RAW 264.7对其免疫调节活性进行了研究。结果表明,桑枝中的主要多糖MBP-2为分子量约29.1 k Da的中性糖,主要由→4)-α-D-Glcp(1→连接的主链构成,并含有α-D-Glcp(1→及→4,6)-α-D-Glcp(1→的葡聚糖结构。该多糖可能主要通过与RAW 264.7细胞表面的TLR4受体结合,激活TRIF依赖的信号通路,从而激活相关炎症因子m RNA的表达,促进NO及细胞因子(IL-6及TNF-α)的释放,发挥免疫调节活性。以上结果为桑枝多糖的应用研究提供了新思路。