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番鸭呼肠孤病毒(MDRV)主要侵害4～45日龄的番鸭,死亡率很高,临床上以软脚,腹泻等为主要症状,以肝、脾肿大及灰白色坏死点等为主要病变,耐过番鸭常出现明显的生长停滞。该病能够引发免疫机能抑制,削弱机体免疫力,很容易继发其它病原的复合感染,从而加重病情,已经成为严重危害番鸭养殖业的主要传染病之一。鸡源呼肠孤病毒(CRV)σNS非结构蛋白作为一种可以聚集于病毒复制工厂内的RNA结合蛋白,可能在病毒RNA组装以及复制周期中发挥重要作用。而目前MDRV的相关功能性研究还未有报道,对MDRV YB株σNS基因及氨基酸序列的Blast分析表明,MDRV与CRV σNS蛋白可能具有类似的功能。本试验首次完成了 MDRV YB株σNS基因的可溶性原核表达和真核表达,并制备了特异性良好的兔多克隆抗体,这将有助于进一步研究该蛋白功能以及获悉MDRV的基因组复制机理和致病机理,最终为有效防治MDRV感染提供参考。为制备MDRV YB株σNS蛋白的多克隆抗体,本试验首先经RT-PCR扩增了σNS基因的完整编码序列(CDS),连接到原核表达载体pET-32a中,经过PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定,表明成功构建了原核重组质粒pET-YB-σNS;将其转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析结果显示成功高效表达出分子量约为58 ku的融合蛋白(p-σNS),Bandscan5.0分析可知p-σNS蛋白的表达量高达菌体总蛋白量的68%;可溶性分析显示该蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在;对p-σNS蛋白的诱导条件进行优化,结果显示IPTG最佳诱导时间、浓度和温度分别为4h,1 mmol/L和37℃;随后对包涵体和可溶性蛋白进行尿素洗涤纯化和(或)Ni2+柱亲和层析纯化,均能得到高纯度蛋白;分别对纯化前后的p-σNS蛋白进行Western-blot分析,结果显示,二者均能特异性识别MDRV阳性血清,表明其具备良好的反应原性;最后用纯化后的可溶性p-σNS蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体ELISA效价大于1:32 000,且特异性良好。此外,后续试验表明,该多克隆抗体亦可以与MDRV全病毒复制产生的v-σNS发生特异性识别。为实现MDRV YB株σNS蛋白的真核表达,首先经PCR扩增了σNS基因完整CDS区,连接到携带flag标签的真核表达载体pCI-neo-flag,双酶切鉴定及测序鉴定表明成功构建了真核重组质粒pCI-flag-σNS;使用ViaFect转染试剂将其转染至DF-1细胞,采用半定量RT-PCR法检测σNS基因的转录水平,Western-blot分析真核表达蛋白(e-σNS)的表达水平。RT-PCR结果显示,σNS mRNA水平在转染后0～36 h逐渐递增,48 h时出现下降;Western-blot鉴定结果显示,e-σNS蛋白与flag鼠单克隆抗体和MDRV-σNS兔多克隆抗体均能发生特异性反应,且转染后36～48 h蛋白表达量最大。以上结果均表明MDRV-YB σNS基因在DF-1细胞中得到了正确的表达,为后续蛋白功能的深入研究奠定了基础。