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研究背景心肌肥厚是临床上各种心脏疾病的晚期阶段。在我国,其发病率逐年增加,在心肌衰竭发生原因中位居首位。尽管如此,我们对心肌肥厚的发病机制尚缺乏深入且系统的了解。但可以肯定的是心肌肥厚的发生是一个涉及多基因、多环节、多途径的病理过程,其中涉及了许多基因发生改变。microRNA作为一类新近发现的小分子(长度约18-24个核苷酸)单链非编码RNA,其强大的基因调控功能已经不断为人们所认识。研究发现在心肌肥厚中也存在microRNA的异常表达。因此,在心肌肥厚发生与发展过程中microRNA可能有重要的调控作用。研究目的本研究采用定量PCR的方法验证了miR-214在心肌肥厚细胞模型及心肌肥厚组织模型中的表达情况,并构建miR-214转基因小鼠鉴定miR-214在心肌肥厚中的生物学功能。同时,通过生物信息学方法对miR-214作用靶点进行预测并进行验证,并进一步研究miR-214在心肌肥厚发生过程中作用的信号通路及调控机制。研究方法1.采用定量PCR法在PE刺激的心肌肥厚细胞模型和8只TAC大鼠心肌肥厚模型中进行miR-214表达量的检测,并统计分析细胞免疫荧光实验中心肌细胞肥厚模型中细胞面积增大情况,以及用定量PCR检测心肌肥厚细胞模型和TAC大鼠模型心肌组织中心肌肥厚基因的表达情况。2.通过构建miR-214转基因小鼠模型来进行获得性功能实验。以心脏超声结果、HW/BW和HW/TL指数、心肌肥厚基因表达量、心肌组织免疫组化结果来分析miR-214过表达对心肌肥厚及心脏功能的影响。3.结合miRNA靶基因在线数据库对miR-214进行靶基因的预测,并利用miR-214模拟体和抑制体的质粒转染后采用定量PCR、Western Blot等方法对靶基因及靶蛋白表达量进行了验证,同时利用荧光素酶双报告检测系统对miR-214的作用的靶序列进行验证。4.用慢病毒表达质粒Lentivirus构建miR-214过表达质粒和miR-214Sponge抑制体质粒,并分别转染乳鼠心肌细胞,观察它们对细胞面积,心肌肥厚基因和miR-214的靶基因的影响。5.构建antagomir-214抑制体,分别给6只TAC小鼠模型尾静脉注射antagomir-214,观察其挽救心肌组织肥厚、miRNA-214靶基因抑制和心脏功能损害的效果。研究结果1.用PE刺激的心肌肥厚细胞48小时后,经细胞免疫荧光检测后发现心肌肥厚细胞模型面积显著增大,定量PCR检测miR-214表达量发现在心肌肥厚细胞中miR-214表达量要显著高于正常心肌细胞。在选取的8只TAC大鼠心肌肥厚模型中,大体形态观发现TAC组大鼠心肌组织明显肥厚,HW/BW指数比Sham组大鼠显著增加,定量PCR检测发现心肌肥厚基因Actal,Myh7,Nppa明显上调。荧光定量PCR检测miR-214在TAC组大鼠心肌组织中表达量,与Sham组大鼠心肌组织相比统计学上有显著差异。2.用西门子超声仪M型超声检测miR-214转基因小鼠发现与对照组小鼠相比LVIDs和LVIDd数值增加,LVPWs数值下降,EF%、FS%数值下降,LVM/BW比值明显增加。MiR-214转基因小鼠心脏大体形态上与对照组小鼠相比明显肥厚,HW/BW和HW/TL指数明显增加,定量PCR检测miR-214基因表达量与对照组小鼠相比增加5倍。同时,MiR-214转基因小鼠心肌肥厚基因Acta1, Myh7,Nppa明显上调,HE染色及免疫组化结果提示miR-214转基因小鼠心肌细胞明显肥厚。3.生物信息学方法预测发现EZH23’-UTR与miR-214种子序列匹配较好,且相互作用的序列在不同物种间具有高度保守性。定量PCR分析转染miR-214mimic后下调EZH2mRNA表达量65%,而转染miR-214inhibitor后上调EHZ2mRNA达量2倍,Westernblot分析EZH2蛋白表达量变化与mRNA表达量变化相同。通过荧光素酶双报告系统检测miR-214可以抑制携带野生型EZH23’-UTR的萤火虫荧光素酶活性,而携带突变型EZH23’-UTR的萤火虫荧光素酶活性不受miR-214影响。4.转染Lenti-miR-214的慢病毒质粒的大鼠心肌细胞比Lenti-vector质粒的大鼠心肌细胞的miR-214表达量升高约33倍,心肌细胞面积显著增加,心肌肥厚基因Actal、Myh7、Nppa表达明显上调；同时,转染Lenti-Spg的大鼠心肌细胞中miR-214表达量显著下降,细胞免疫荧光检测发现Lenti-Spg可以抑制PE刺激后心肌细胞面积的增大,定量PCR分析发现转染Lenti-Spg可以抑制经PE刺激48小时大鼠心肌细胞后心肌肥厚基因表达量的上升。转染Lenti-miR-214可以提高EZH2mRNA表达量上调,下调Six1mRNA表达量；转染Lenti-Spg可以抑制经PE刺激48小时后心肌细胞中EZH2mRNA表达量下调和Sixl mRNA表达量上调。5.TAC小鼠模型通过尾静脉注射Antagomir-214后可以挽救心肌中的EZH2蛋白量表达下调,并降低HW/BW和HW/TL指数,而HE染色和免疫组化结果提示心肌肥厚程度明显缓解,定量PCR检测心肌肥厚标志物(Actal,Myh7,Nppa)发现antagomir-214可以减少心肌肥厚基因的表达量,通过M型心脏超声结果发现antagomir-214可以挽救TAC组小鼠LVPWd,EF%, FS%和LVW/BW的损害。研究结论1.MiR-214在心肌细胞肥厚模型和TAC心肌肥厚组织中高表达,表明miR-214在心肌肥厚的病理过程中起调控作用。2.通过构建miR-214转基因小鼠体内模型,可以诱导心肌组织肥厚,进一步损害心脏功能,提示miR-214是影响心脏功能的关键分子。3.MiR-214过表达可以抑制EZH2蛋白产生,进而对心肌肥厚产生影响。而在这过程当中,EZH2的下游调节基因Sixl是miR-214所诱导的心肌肥厚的重要媒介。MiR-214在转录水平即对EZH2产生抑制。MiR-214对EHZ2的抑制是通过其种子序列与EZH23’-UTR上序列交互作用产生的。EZH2是miR-214的直接调控靶点。可以通过抑制的MiR-214表达,产生对心肌肥厚和心脏功能损害的挽救作用。