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目的肝纤维化(hepatic fibrosis)是肝硬化前期的病理过程,可由多种原因引起,在我国主要是乙型病毒性肝炎,酒精性肝纤维化作为其病因近年也呈上升趋势,目前对于肝纤维化的防治尚无确切有效的手段。肝纤维化的主要病理过程是细胞外基质(extra cell matrim,ECM)沉积,而Ⅰ型胶原是ECM的主要成分,正常肝脏胶原蛋白占总蛋白5-10%,其中Ⅰ型胶原蛋白占总胶原蛋白的40-50%,Ⅲ型胶原蛋白占总胶原蛋白的40-50%,肝纤维化时胶原蛋白可占总蛋白的50%甚至更多,其中Ⅰ型胶原蛋白占总胶原蛋白的比例升至60-70%,Ⅲ型胶原蛋白降至20-30%。可见肝纤维化时主要是肝脏中Ⅰ型胶原过度增加的结果。现已证明,肝纤维化是一种可逆的病理过程,因此本研究设计针对大鼠前Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)基因的siRNA并构建重组质粒,同时检测其对Ⅰ型胶原蛋白表达的抑制效果,为肝纤维化的基因治疗提供新的靶标。实验材料与方法一、实验材料真核表达载体pGPU6/GFP/Neo、E.coli DH5α、质粒抽提试剂盒、限制性内切酶BamHⅠ、BbsⅠ、PstⅠ、T4连接酶、Taq酶、Lipofectamine 2000、G418、COL1A1兔多克隆抗体、β-actin兔抗人多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗、大鼠肝星状T6细胞二、实验方法1、筛选siRNA序列和构建重组质粒从NCBI网站获得大鼠的COL1A1 cDNA序列,设计3个针对COL1A1基因不同位点的siRNA序列,合成双链DNA(double-stranded DNA)连接到带有U6启动子的pGPU6/GFP/Neo载体上,分别命名为pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C。2、细胞转染通过脂质体介导的方法将重组质粒转染到大鼠肝星状细胞株HSC-T6细胞中。经G418进行稳定筛选,2周后选择单克隆扩大培养。3、检测抑制效果采用蛋白印迹(Western blotting)方法检测Ⅰ型胶原蛋白表达情况。4、统计处理实验数据以(?)±s表示,采用SPSS13.0软件分析数据,组间比较采用多组单因素方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。实验结果1、选择的针对COL1A1基因的siRNA序列COL1A1-A:5′-GAGTATGGAAGCGAAGGTTCC-3′,3′-CTCATACCTTCGCTTCCAAGG-5′.COL1A1-B:5′-ACAAGGTGACAGAGGCATAAA-3′,3′-TGTTCCACTGTCTCCGTATTT-5′;COL1A1-C:5′-TGATGGTTCTCCTGGCAAAGA-3′,3′-ACTACCAAGAGGACCGTTTCT-5′2、重组质粒经BamHⅠ、PstⅠ分别单酶切后,阳性质粒进行测序分析,结果证实靶向COL1A1 mRNA的3个重组质粒的shRNA序列与设计的完全一致,构建成功。3、经Western blotting证实重组质粒对肝星状细胞COL1A1蛋白的抑制率分别为26.93%44.86%、66.29%。结论成功构建了3个针对大鼠COL1A1的质粒载体,对Ⅰ型胶原的表达都产生了抑制,尤以pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C的效果明显,从而为肝纤维化的治疗提供新的途径。