【摘 要】
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威尔逊病（Wilson Disease,WD）,是铜代谢异常的常染色体隐性遗传疾病,在中国的发病率显著高于西方国家。临床上,因为致病基因ATP7B的突变类型多样,误诊率高,且中国的临床试验较少,因此亟需开发针对中国WD患者的准确高效的治疗策略。本研究探讨了基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的WD模型小鼠的基因修复研究,包括利用SpCas9和AAV介导的Atp7b第8号外显子替换和xCas9-A
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威尔逊病（Wilson Disease,WD）,是铜代谢异常的常染色体隐性遗传疾病,在中国的发病率显著高于西方国家。临床上,因为致病基因ATP7B的突变类型多样,误诊率高,且中国的临床试验较少,因此亟需开发针对中国WD患者的准确高效的治疗策略。本研究探讨了基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的WD模型小鼠的基因修复研究,包括利用SpCas9和AAV介导的Atp7b第8号外显子替换和xCas9-ABE介导的单碱基编辑治疗WD两部分研究。（一）以Lenti CRISPRv2GFP为载体骨架改造构建了TBG-SpCas9-GFP慢病毒载体,并通过显微操作感染小鼠受精卵,流式检测及免疫组化分析表明在F0代和F1代某些小鼠肝脏组织中有约10%GFP阳性细胞聚群分布,表明该小鼠能够持久稳定表达Cas9蛋白。在Cas9阳性F1代小鼠出生第2天通过颞浅静脉注射携带sg RNA与修复片段的r AAV8病毒（AAV-U6sg-DDFE8）,一周后高通量测序和定量实时PCR检测结果表明GFP阳性细胞中Atp7b基因8号外显子替代率为16.34±4.02%,同时小鼠整个肝脏中基因替换比率为1.81%±0.29%。本研究首次尝试利用CRISPR/Cas9构建cas9阳性小鼠并实现其Atp7b基因整个8号外显子的置换,对ATP7B突变引起的WD患者提供了基因治疗参考。（二）根据ABE-xCas9编辑系统的特性,设计了三条针对tx-j小鼠Atp7b第8号外显子上第2135位G到A点突变的sg RNA,并将其分别构建到sg RNAABE-xCas9-GFP载体。将载体转染携带tx-j小鼠Atp7b突变位点基因片段的293T细胞株,测序结果表明三条sg RNA都能介导基因编辑,其中sg RNA19具有高达37.45%的基因编辑效率。我们采用高压尾静脉注射的方式,将sg RNA19-ABExCas9-GFP导入tx-j小鼠体内,实现肝脏组织12.5%的转染效率和1.475%的基因修正比例。在高铜饮食条件下,检测sg RNA19-ABE-xCas9系统对tx-j小鼠的治疗效果,病理结果证明sg RNA19介导的ABE-xCas9基因编辑系统可以轻度缓解tx-j小鼠的病症（减慢肝细胞核增大症状和促进血清铜蓝蛋白水平的回升）。本研究首次采用ABE-xCas9基因编辑系统,实现了对tx-j小鼠中Atp7b点突变位点的37.45%的体外编辑效率和体内肝脏组织的1.475%的基因修正比例,从而轻度缓解了tx-j小鼠高铜饮食下的病理症状。该研究为ABE-xCas9基因编辑系统在WD的基因治疗中的应用提供重要的理论依据。
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