论文部分内容阅读
植物在与微生物长期的共进化中形成了植物先天性免疫机制以保护自身免受病原物侵袭,通过细胞膜上模式识别受体而诱发的免疫为植物先天性免疫的第一层防线。植物识别病原物后胞内钙离子浓度升高是一种典型的早期免疫响应,植物中钙离子结合蛋白通过感知胞内钙离子浓度改变引发下游信号传导。钙依赖蛋白激酶作为一种典型的钙结合蛋白,参与植物生长、发育、生物与非生物胁迫响应和胞内激素调节。前期研究表明,水稻钙依赖蛋白激酶OsCPK4在水稻耐盐、耐旱及生长发育中起到重要作用,而对于OsCPK4在植物先天免疫中发挥作用的具体分子机制并不明确。本研究通过对oscpk4突变体的表型分析及生物化学等试验手段,研究了 OsCPK4在水稻先天性免疫中的功能及互作蛋白,并深入探究了其潜在的作用机理。具体结果如下:首先,通过系列试验探究了 OsCPK4在水稻先天性免疫中所起的作用,一、当水稻悬浮细胞及幼苗分别用chitin和flg22处理后,OsCPK4的表达都在早期迅速升高,表明OsCPK4为早期响应病原相关分子模式（P athogen-associated molecular pattern,PAMP）的基因。二、获取并鉴定得到两个独立的oscpk4突变体株系,并通过活性氧（Reactive oxygen species,ROS）检测,发现oscpk4突变体相比于野生型中ROS积累显著提高,且突变体中病程相关基因的表达在未受到PAMP处理时亦显著高于野生型。三、通过对两个独立oscpk4突变体株系的稻瘟病菌及白叶枯病菌的接菌试验,发现oscpk4突变体相比于野生型抗病性显著增强。证明OsCPK4负调控水稻对病原真菌稻瘟菌及病原细菌白叶枯菌的抗性。以上结果表明OsCPK4在水稻免疫中起负调控作用。为进一步探究OsCPK4如何在水稻免疫中发挥作用,本研究通过双分子荧光互补,免疫共沉淀等生化试验,验证了 OsCPK4与水稻免疫中重要的正调控因子类受体胞内激酶OsRLCK176互作,且两者之间的互作具有特异性。通过烟草共表达及体外降解试验,发现OsCPK4可通过介导OsRLCK176的降解从而负调控水稻先天免疫反应。此外,为了探究OsCPK4与OsRLCK176在水稻抗病信号转导中具体的作用机制,本研究利用水稻原生质体及烟草表达体系瞬时表达OsCPK4和OsRLCK176,在受PAMP处理后,这些瞬时表达的蛋白均被磷酸化,表明OsCPK4及OsRLCK176在PAMP触发的免疫（PAMP-triggered immunity,PTI）反应中均被激活。体外及胶内磷酸化试验表明OsCPK4与OsRLCK176相互磷酸化,而OsCPK4对OsRLCK176的磷酸化在植物感知PAMP时增强。有趣的是,OsCPK4-OsRLCK176通路的激活会缓解OsRLCK176的降解,从而使植物在抗病反应被诱导时维持OsRLCK176蛋白的稳定。最后,本研究还发现OsCPK4与水稻抗性负调控子OsMPK3在体外互作,OsCPK4,OsRLCK176和OsMPK3在体内两两互作,暗示三个蛋白在体内形成一个复合体而发挥作用。此外,OsCPK4与OsMPK3,OsMPK4,OsMPK7在体外互为磷酸化,胶内激酶试验发现受到flg22处理后,oscpk4突变体中总的OsMPK激酶活性相比于处理后野生型中的OsMPK激酶活性显著下降,暗示OsCPK4也通过作用于OsMPK信号通路在抗性反应中发挥功能。综上,研究发现水稻在未受病原物侵染时,OsCPK4可以通过降解OsRLCK176从而抑制免疫反应而维持水稻的正常生长发育;另一方面,当水稻感知病原物侵染时,OsCPK4可以通过磷酸化OsRLCK176从而缓解OsRLCK176的降解,从而维持OsRLCK176所介导的免疫反应。此外,OsCPK4同时作用于OsMPK信号通路调节抗性反应,该研究揭示了一种新型的植物免疫精准调控机制,丰富了人们对水稻先天免疫分子机制的理解。