第一部分咖啡酸对造血干细胞增殖和分化的影响及其机制探究研究背景:咖啡酸化学名称为3,4-二羟基苯丙烯酸(反式),是一种植物生长调节剂,广泛分布于包括水果、粮食作物、中草药在内的各类植物中。同时咖啡酸系多种植物成分如绿原酸、朝蓟素及某些香豆素类等的中间体。目前,咖啡酸是在我们国家临床工作上早已广泛应用的一种用于升血和止血的原研于我国的药物。自上世纪70年代以来,我国医学科研工作者陆续报道了其具有止血、提升白细胞和血小板以及利胆、降血脂等多方面作用;随着时代的发展涌现出的许多新进研究发现其还具多种多样的奇妙用途,例如:抗病毒、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用。近年来,咖啡酸广泛应用于各种原因引起的血小板及白细胞减低,如放化疗后骨髓抑制、再生障碍性贫血及免疫性血小板减少症等。尽管咖啡酸在我国临床应用广泛,然而对其升白细胞、升血小板作用机制的研究尚无明确国际认可的全面报道。因此,本研究对咖啡酸作用机制的探究,为咖啡酸这一原研药物的临床应用和国际推广提供了可靠的理论基础支持。研究目的:研究咖啡酸促进造血的作用机制,明确咖啡酸对体外脐血来源造血干细胞增殖及分化的影响,探究咖啡酸对体内各类组织细胞增殖影响的差异。研究方法:1.收集足月正常妊娠脐血80-100 mL,用明胶沉降红细胞后,Ficoll法分离单个核细胞,并用免疫磁珠法分选CD34+细胞。2.建立含有人干细胞因子(stem cell factor,SCF)、rhTPO、FLT3 配体(FLT3 ligand,FLT3L)的无血清扩增培养基(serum free expansion medium,SFEM)造血干细胞扩增体系。3.在CD34+细胞种入24孔板扩增体系后,各组分别加入浓度为0、10或50μg/mL的咖啡酸(分别定义为E0、E1、E2组),培养6天后,细胞计数仪计数各孔总细胞,流式法测定CD34+细胞比例。4.对照组和10 μg/mL咖啡酸加药组扩增后细胞分别进行细胞集落生成实验。将各组扩增后细胞,分别接种于含或不含咖啡酸的半固体培养基造血干细胞分化体系(分别定义为D0(不含咖啡酸半固体培养基)和D1组(含咖啡酸半固体培养基),即扩增体系的E0、E1组在分化体系又分别分为DO和D1两组),密度为500 CFU/mL,培养14天。第14天低倍镜下计数各培养皿内BFU-E、CFU-G、CFU-M、CFU-GM 及 CFU-GEMM。5.各组扩增后细胞分别向粒、红、巨核或淋巴细胞方向诱导分化。培养至相应天数时,计数各自细胞总数,流式检测相应细胞表面标志。此外,在巨核细胞诱导分化培养14天后观察各组细胞形态,流式细胞法测定巨核细胞倍体情况。6.给与小鼠临床等效剂量咖啡酸或赋形剂对照口服给药14天,每3天测一次小鼠血常规。于第7天开始腹腔注射BrdU。第14天,流式细胞法测定小鼠骨髓造血干细胞占骨髓有核细胞比例及其BrdU摄取能力;同时测定对小鼠lgr5+肠上皮隐窝干细胞和sca-1+肺上皮干细胞比例及BrdU摄取能力的影响。研究结果:1.造血干细胞扩增实验中,在CD34+细胞培养6天后,10 μg/mL咖啡酸加药组细胞总数(8.45±4.89)×105,显著高于对照组细胞总数为(6.23±4.24)×105,P=0.006。而50μg/mL咖啡酸加药组细胞总数较对照组无明显差异。2.造血干细胞集落形成实验中,无咖啡酸半固体培养基培养后,扩增过程10μg/mL咖啡酸加药组(E1D0)与扩增过程不加药组(E0D0)集落形成能力及各类型集落比例无明显差别。含咖啡酸半固体培养基培养后,扩增过程10 μg/mL咖啡酸加药组(E1D1)与扩增过程不加药组(E0D1)集落形成能力及各类型集落比例无明显差别,且与无咖啡酸半固体培养基培养组无显著差异。3.巨核细胞诱导实验中,咖啡酸组或对照组扩增后造血干细胞,在无咖啡酸诱导分化体系内培养,第7天时,测得扩增过程10 μg/mL咖啡酸加药组(E1)CD34+造血祖细胞比例为(20.91±2.9)%,显著高于扩增过程不加药组(E0)CD34+比例(11.89±2.3)%,P=0.013,未成熟巨核细胞比例显著高于对照组,成熟巨核细胞比例显著低于对照组。第14天时扩增过程10 μg/mL咖啡酸加药组(E1)与扩增过程不加药组(E0)间差异消失。而50 μg/mL咖啡酸加药组(E2)镜下观察细胞状态不佳,未进一步检测,考虑长时间高浓度咖啡酸对细胞有一定抑制作用。此外,扩增过程未加药的造血干细胞在含或不含咖啡酸的诱导分化体系内培养,各指标在各组间均无明显差异。4.红细胞诱导实验中,第14天对照组、单扩增过程加药组、单分化过程加药组、扩增分化均加药组的CD235a阳性率(%)分别为:93.1 ± 5.1、92.4±2.8、91.4±3.9、95.7 ± 1.9,后三组与对照组间P值分别:0.763、0.158、0.463。各组的总细胞数亦无明显差异。5.粒细胞诱导实验中,第14天对照组、单扩增过程加药组、单分化过程加药组、扩增分化均加药组的CD15阳性率(%)分别为:83.9±6.1、82.7±8.9、84.0±9.6、86.2 ± 10.6,后三组与对照组相比 P 值分别:0.543、0.978、0.584。各组的总细胞数同样无明显差异。6.T淋巴细胞诱导实验中,第11天对照组、单扩增过程加药组、单分化过程加药组、扩增分化均加药组的CD3阳性率(%)分别为:88.6±4.6、92.4±2.8、91.4±3.9、95.7±1.9,后三组与对照组相比P值分别:0.271、0.532、0.199。各组的总细胞数无明显差异。7.B淋巴细胞诱导实验中,第14天对照组、单扩增过程加药组、单分化过程加药组、扩增分化均加药组的CD19阳性率(%)分别为:9.5±0.8、9.9±2.2、8.6±0.8、11.2 ± 1.0,后三组与对照组相比P值分别:0.823、0.134、0.203。未观察到各组细胞总数存在显著统计学差异。8.小鼠咖啡酸给药后,血常规各指标无明显改变。给药14天后,咖啡酸给药组小鼠骨髓LSK造血干细胞比例与对照相比无统计学差异。通过流式细胞法检测造血干细胞BrdU摄取能力,咖啡酸给药组小鼠骨髓单个核细胞BrdU摄取率显著高于对照组。骨髓单个核细胞G2/M期比例两组间无明显差异。而小鼠lgr5+肠上皮隐窝干细胞和sca-1+肺上皮干细胞比例及组织细胞BrdU摄取能力,在咖啡酸组与对照组间无明显差异。研究结论:1.咖啡酸可促进人脐血来源造血干细胞扩增,维持扩增过程中CD34+细胞比例。2.人脐血来源造血干细胞扩增过程中是否加入咖啡酸对后续细胞集落形成能力及对向各系细胞诱导分化过程无明显影响,但可使巨核细胞表面特异性标志表达提前。3.集落形成或向各系诱导分化过程是否加咖啡酸对人脐血来源造血干细胞分化过程无明显影响。4.小鼠口服咖啡酸14天,骨髓造血干细胞DNA合成旺盛,而小鼠lgr5+肠上皮隐窝干细胞和sca-1+肺上皮干细胞均未观察到类似现象,提示该现象具有组织特异性。第二部分咖啡酸对小鼠的生殖毒性和发育毒性研究研究背景:妊娠期合并血小板减少在妊娠妇女中发病率为6%-1 0%,发生率约为同龄非妊娠妇女的4倍,主要包括妊娠期血小板减少和免疫性血小板减少症等。考虑妊娠期合并血小板减少对胎儿已知或未知的风险,国内外近1 0年对妊娠期合并血小板减少的治疗尤为重视,其主要治疗药物为糖皮质激素、血小板生成素受体激动剂和静脉应用免疫球蛋白。然而,主要的治疗方案对母体及胎儿均有或多或少的不良影响。考虑胎盘影响,泼尼松优于地塞米松,但长期应用泼尼松会增加胎儿腭裂及产妇妊娠糖尿病风险;静脉应用免疫球蛋白因可透过胎盘结合于胎儿红细胞表面,仅用于激素无效患者;血小板生成素受体激动剂及重组人血小板生成素暂无相关生殖毒性研究报道。因此,临床急需寻找一种妊娠期可用的升血小板药物。咖啡酸作为中国自主研发的升血小板药物,对提升妊娠期合并血小板减少患者的血小板水平或有所帮助。咖啡酸是临床常用的升血和止血药物,但对于其生殖及发育毒性尚缺乏系统研究。我们对咖啡酸在雌性小鼠妊娠前期、妊娠期及哺乳期的生殖毒性及在子代小鼠胚胎期、哺乳期的发育毒性进行了国际标准化的系统性研究。研究目的:以小鼠为模型,探究咖啡酸在小鼠生殖和发育过程中对母体、胚胎、胎仔的影响,系统性评价咖啡酸是否存在生殖发育毒性,以对临床应用提供初步研究基础。研究方法:1.所有实验步骤符合国家食品药品监督管理局颁布的药物非临床研究质量管理规范、药物非临床安全性研究技术指导原则及药物生殖毒性研究技术指导原则。2.咖啡酸原料药,颗粒度<100目,以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)制备混悬液,以灌胃方式给药,给药频率每天一次,药物溶液现用现配。本实验设定剂量组为:1、对照组:0.5%CMC-Na;2、低浓度组:CFA 0.15 mg/kg/d;3、中浓度组:CFA5 mg/kg/d;4、高浓度组:CFA 150 mg/kg/d。3.Ⅰ段生育力与早期胚胎发育毒性试验,本段实验包括交配前到受孕阶段和受孕到着床阶段,对F0代雌鼠由交配前2周到交配期直至胚胎着床(妊娠第5天,G5)给药。通过交配率、黄体数、着床数等指标,评价受试物对动物生育力的影响。4.Ⅱ段胚胎-胎仔发育毒性试验,本段实验包括从胚胎着床到妊娠终止,以及从出生到仔鼠离乳两个阶段,对F0代雌鼠由着床完成(妊娠第6天,G6)到妊娠第15天(G15)给药。通过staple解剖观察法,评价此阶段咖啡酸干预对胚胎及胎仔的影响。5.全程式生殖毒性试验,本段实验F0代雌鼠生育过程中全程暴露于药物作用,以全面观察咖啡酸对生殖毒性的长期影响。对F0代雌鼠由交配前2周到仔鼠离乳(分娩第21天,post-parturition day 21,P21)给药。观察活死产数、胎仔存活率及各项发育指标,以评价此阶段咖啡酸干预对小鼠生殖发育的影响。研究结果:1.Ⅰ段生育力与早期胚胎发育毒性试验中,咖啡酸中、高浓度组胚胎植入数、着床率、活胎数显著降低,植入前丢失显著增加;各浓度组F0雌性未观察到母体毒性,去子宫母体增重、交配率、黄体数、死胎数、植入后丢失、活胎体重与对照组均无显著差异。2.Ⅱ段胚胎-胎仔发育毒性试验中,咖啡酸高浓度组胎重显著低于对照组,但中、低浓度组未观察到这一现象。各浓度组F0雌性未观察到母体毒性,胎仔外观、内脏、骨骼未观察到给药相关的畸形及变异情况,活胎数、死胎数、畸胎数与对照组均无显著差异。3.全程式生殖毒性试验中,咖啡酸高浓度组胎鼠出生体重显著低于对照组,离乳体重与对照组无显著差异。各浓度组F0雌性未观察到母体毒性,仔鼠活产数、死产数、4天存活率、21天存活率、各神经发育指标与对照组均无明显差异。研究结论:1.本研究中,咖啡酸在给药量为5 mg/kg/d和150 mg/kg/d时,可观察到对早期妊娠的小鼠有明显的抗着床作用。2.在胚胎植入后开始咖啡酸给药未观察到流产、致畸等不良事件。3.全程高浓度咖啡酸给药对胎仔出生时体重增量的影响可随时间恢复。4.本实验条件下,用现有评价指标未观察到任何与咖啡酸给药相关的生殖发育毒性作用的最大染毒剂量,即无明显损害作用水平(NOAEL)为0.15 mg/kg/d。