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目的:利用HREs(缺氧反应元件hypoxia responsible elements)调控元件乏氧诱导的特性,和放射诱导性的Egr-l(早期生长因子early growthresponse-1)启动子构建融合启动子HREl.Egr-1调控yCDglyTK基因表达进行鼻咽癌基因-放射治疗研究,以进一步减少鼻咽癌乏氧细胞的辐射抗性,为探索鼻咽癌的放射治疗开辟新思路和新途径。
方法:在我校唐瑶云博士构建的质粒pcDNA3.1(-)CMVe·Egr-lyCDglyTK的基础上,运用酶切、PCR,连接等方法构建pcDNA3.1(-)HREl.Egr-1.yCDglyTK质粒表达载体。采用脂质体转染方法将pcDNA3.1(-)HREl.Egr-1.yCDglyTK质粒转染入鼻咽癌HNE-1细胞系,分别用RT-PCR方法和Western-blot杂交方法鉴定yCDglyTK基因在鼻咽癌HNE-1细胞内的表达,建立了稳定表达yCDglyTK基因的鼻咽癌HNE-1细胞株;用Western-blot杂交方法鉴定yCDglyTK基因分别在常氧、乏氧、不同剂量丫射线照射及乏氧/放射处理后的表达强度;MTT法检测自杀基因前药系统yCDglyTK/5-FC对yCDglyTK阳性HNE-1细胞分别在常氧、乏氧、不同剂量丫射线照射及乏氧/放射处理后的杀伤效应。
结果:
1.成功的构建了pcDNA3.1(-)HREl.Egr-1.yCDglyTK质粒表达载体。
2.建立了稳定表达yCDglyTK融合自杀基因的鼻咽癌HNE-1细胞株,经鉴定,yCDglyTK自杀基因在阳性克隆细胞中于mRNA和蛋白水平均有表达。
3.Western-blot杂交方法显示yCDglyTK阳性HNE-1细胞分别经单纯放射、乏氧和乏氧/放射处理条件处理后,其蛋白表达明显增强,5-FC对yCDglyTK融合自杀基因阳性鼻咽癌HNE-1细胞在分别经单纯放射、乏氧和乏氧/放射处理条件处理后具有较强的杀伤效应，以乏氧/放射处理最明显。
结论：利用HREl.Egr-1调控yCDglyTK融合自杀基因表达对鼻咽癌HNE-l细胞进行了乏氧条件下的基因-放射治疗体外试验。研究表明：①融合启动子HREl-Egr-1经乏氧、放射诱导可以调控yCDglyTK基因在鼻咽癌HNE-1细胞中强表达。②HREl.Egr-1调控yCDglyTK的自杀基因系统在缺氧条件下可以显著增强鼻咽癌放射治疗效果。为增加鼻咽癌对放射治疗的敏感性，提高鼻咽癌治疗效果进行了有益的探索，为今后进一步进行体内试验打下了坚实的基础。