第一部分A549、A549/DDP细胞ERCC1表达和细胞耐药的关系目的：近20年来,全球肺癌发病率不断升高,已达70/10万。我国的肺癌死亡率在恶性肿瘤中上升幅度最大。而在肺癌治疗中，顺铂是应用最广泛的化疗药物之一，但是由于肿瘤细胞的铂类耐药的存在，使其在临床使用过程中的疗效减弱，严重影响了化疗效果。顺铂广泛应用于非小细胞肺癌、睾丸癌、卵巢癌等的肿瘤治疗。顺铂对肿瘤的细胞毒作用主要是通过形成铂-DNA加合物，影响细胞DNA的复制与转录。而在临床化疗过程中肿瘤细胞耐药性是化疗失败主要原因。多药耐药机制中核苷酸切除修复（nucleotide excision repair,NER）是机体维持基因组功能整体性、修复致癌损伤及抗癌过程中的重要环节。NER途径涉及30多个蛋白，可分为两组： DNA损伤的识别与切除如ERCC1和XPA等； DNA解旋酶如ERCC2、ERCC3等。在NER中，DNA损伤的识别与切除为限速步骤，故ERCC1基因是NER途径的重要因素。近年来关于ERCC1与肿瘤的研究可以分为两类：在癌组织中ERCC1是一种下调基因，其低表达可能与癌症的发生有关。同时ERCC1基因被认为是影响肺癌铂类化疗疗效及预后的相关基因。其表达与使用以铂类为基础的化疗效果呈负相关。本部分实验通过探讨小剂量顺铂作用于人肺腺癌细胞A549、A549/DDP后对其ERCC1基因表达的影响，从而揭示ERCC1在肺腺癌铂类耐药中所起到的重要作用，为解释肺癌对铂类药物耐药的原因提供新的思路。方法：1.细胞来源：实验所用的A549细胞株来源于人类肺腺癌组织，A549/DDP细胞株是基于A549细胞经长期低剂量顺铂诱导后建立的耐药细胞系。2.细胞培养：实验中A549和A549/DDP细胞株用RPMI-1640完全培养液培养，后者在培养过程中需要用低浓度DDP(2μg/ml)维持其耐药性。3.实验分组及干预： A549细胞空白对照组、A549细胞20mg/L顺铂作用组，以及耐药细胞株A549/DDP组。4.以四氮唑蓝比色法（MTT）检测A549/DDP细胞株的相对耐药指数（RI）。5.应用反转录PCR（RT-PCR）和蛋白免疫印迹试验（Western Blot）方法检测细胞ERCC1mRNA及蛋白质的表达。结果：1.用MTT吸光法检测细胞株在490nm处测定吸光度值（OD），按公式计算两株细胞的存活率，利用直线加权回归方程求细胞株的半数有效抑制率（IC50）。结果数据显示：A549/DDP细胞株对于顺铂药物的IC50为203.85±9.745μmol/L，A549细胞株IC50为20.98±3.785μmol/L，前者相对耐药指数为9.72倍。2.在基因和蛋白水平分别检测两株细胞不同的ERCC1表达强度，根据预实验结果，我们选择20mg/L浓度的顺铂作为A549细胞株的条件作用浓度，在经过24小时条件培养基孵育后，A549细胞株ERCC1表达水平有所升高，ERCC1mRNA表达水平由33.12%升高至80.57%， ERCC1蛋白质水平由37.86%升高至71.47%，但与耐药细胞株A549/DDP的ERCC1mRNA和蛋白质表达水平相比仍较低。经统计学检验各组间差异有显著性（P＜0.05）。结论：应用小剂量顺铂处理A549、A549/DDP细胞株后，可以增加细胞中ERCC1基因的表达，同时可能参与了细胞株对铂类耐药的形成。第二部分鸦胆子油联合siRNA-ERCC1基因逆转细胞铂类耐药目的：近年RNA干扰技术（RNA interference, RNAi）应用在抗肿瘤、抗病毒等多方面实验研究，表现出广阔的临床应用前景。RNAi产生类似于基因敲除的效果，为序列特异性转录后基因沉默过程。与传统反义RNA技术相比，RNAi设计简便，操作简单，费用较低，实验周期短。特异性、针对性强，抑制效果明显，在反应过程中只引起同源mRNA降解，而不同源的其他基因不受影响。同时也具有生物高效性，少量siRNA片段转染进靶细胞后即可有效封闭靶向基因，说明RNA干扰过程是以催化放大方式进行的，其抑制作用比单独应用反义RNA要高出数倍。本部分研究研究中分别应用鸦胆子油乳、RNAi技术沉默ERCC1以及两者联合后观察耐药细胞株中ERCC1的表达变化，在细胞水平证明ERCC1参与非小细胞肺癌铂类耐药的过程，并探寻逆转肺癌铂类耐药的有效临床途径。方法：1.细胞来源及培养：本实验中A549/DDP细胞株来源同本文第一部分。2.实验分组及干预：鸦胆子油(0.16mg/L)、siRNA-ERCC1组和鸦胆子油联合RNAi作用组，将完全培养基培养的A549/DDP细胞作为空白对照组。3.应用RT-PCR和Western Blot方法检测各干预组A549/DDP细胞中ERCC1mRNA及蛋白质的表达变化。4.应用MTT吸光度法计算各处理组细胞耐药倍数。结果：1.从基因和蛋白两种水平分别检测不同组组细胞ERCC1表达强度，分别在鸦胆子油作用细胞24小时、siRNA片段转染细胞并培育24小时后获取各实验组细胞用于进一步实验，结果发现空白对照组、鸦胆子油作用组、siRNA-ERCC1作用组和鸦胆子油联合RNA干扰作用组的ERCC1mRNA表达强度为：100.00%、75.56±2.34%、68.18±2.88%、17.02±3.70%，各组ERCC1蛋白质表达强度为：100.00%、80.67±1.48%、70.66±2.84%、15.18±1.53%。经统计学检验各组之间差异有显著性（P＜0.05）。2.用MTT吸光法检测各实验组细胞株在490nm处测定吸光度值（OD），按公式计算细胞株的半数有效抑制浓度（IC50）。结果显示四组细胞IC50分别为：203.85μmol/L、186.10μmol/L、159.15μmol/L、143.33μmol/L。经耐药倍数公式计算后我们得出，各组细胞耐药倍数从9.72倍降至8.87倍、7.59倍、6.83倍。各组之间差异有显著性（P＜0.05）。结论：1.鸦胆子油乳和RNA干扰技术可以有效降低ERCC1基因的表达，特别是在联合应用后能明显逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。2.ERCC1可以作为肺癌铂类耐药逆转的有效靶点，为肺癌在今后的临床治疗中提供更有效的方案。