胶质瘤是一种常见的恶性颅内肿瘤，因其呈侵染性生长，使得手术切除辅以化疗、放疗的传统方法往往难以将其根治，死亡率极高。神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是一种中枢神经系统前体细胞，具有无限自我更新的潜能且能分化为神经元，星型胶质细胞及少突胶质细胞。NSCs的迁移能力对神经系统的发育和修复起到至关重要的作用。近年来研究发现NSCs具有向胶质瘤定向迁移的能力，使其成为最具潜力的胶质瘤靶向基因治疗载体之一。Rac1是Rho家族小G蛋白成员之一，它通过活性的GTP结合形式和非活性的GDP结合形式间的转化，调控板状伪足的产生和膜褶皱样运动等多种细胞生理过程，被认为是细胞迁移重要的调控分子之一。为了更加正确有效的利用NSCs作为胶质瘤基因治疗的载体，胶质瘤趋化NSCs定向迁移的潜在调控机制亟需被阐明。目前的研究多集中于胶质瘤产生的细胞因子或细胞外基质对诱导NSCs定向迁移的作用，而NSCs应答外来信号并调控自身迁移变化的细胞内部分子机制的研究还很少。 在本实验中，我们首先提取了本实验室分离培养的大鼠间充质干细胞的总RNA，通过RT—PCR的方法克隆得到了大鼠的Rac1（NCBI Accesssion number：NM_134366） cDNA，将其TA克隆至pMD19—T载体上。DNA测序鉴定正确的重组载体命名为pMD19—T—Rac1，质粒抽提试剂盒提取重组载体，以之为模板使用Quik—Change定点突变技术快速构建Rac1组成型激活突变体Rac1—Q61L、Rac1—G12V、和Rac1显性阴性突变体Rac1—T17N。DNA测序鉴定的上述三突变体，测序正确的阳性克隆分别命名为pMD19—T—Rac1Q61L、pMD19—T—Rac1G12V、pMD19—T—Rac1T17N。使用 SalⅠ， XhoⅠ双酶切pMD19—T—Rac1、pMD19—T—Rac1G12V、pMD19—T—Rac1T17N，胶回收约580 bp的目的小片段。上述同样的酶双酶切IRES真核表达载体pIRES2-EGFP，胶回收载体大片段。T4连接酶16℃过夜连接上述回收的大小片段，转化E coli． TOP10菌，随机挑取克隆DNA测序鉴定。测序正确的重组载体分别命名为pIRES2-EGFP—Rac1、pIRES2-EGFP—Rac1G12V、pIRES2-EGFP—Rac1T17N。 同时我们使用Invitrogen公司的RNA干扰（RNAi）在线设计工具：BLOCK—iTTMRNAi Designer针对大鼠Rac1基因设计优选三对干扰序列，送公司合成单链寡核苷酸片段后退火定向克隆至RNAi表达载体pcDNA6．2-GW/EmGFP—miR中，转化感受态细胞挑取单克隆，DNA测序鉴定。鉴定正确的重组载体分别命名为pcDNA6．2-GW/EmGFP—miR1、2、3。 最后抽提上述构建的真核表达载体pIRES2-EGFP—Rac1，pcDNA6．2-GW/EmGFP—miR2脂质体法转染C17．2神经干细胞系，分别用于上调和下调C17．2细胞中Rac1的表达水平。抽提载体pIRES2-EGFP—Rac1G12V，pIRES2-EGFP—Rac1T17N转染C17．2神经干细胞系，以改变C17．2细胞中Rac1的活性状态。其中Rac1G12V能够持续保持GTP结合的激活状态，Rac1T17N能够竞争性抑制GEF对Rac1的作用，从而阻断Rac1活性。 转染24-48 h内，使用Leica DMI6000B活细胞工作站活细胞拍摄。使用ImageJ软件及其插件Manual Tracking分别对GFP阳性和GFP阴性的细胞进行迁移行为的统计分析。统计结果显示，分别上调和下调Rac1的表达水平并不能显著改变C17．2细胞的迁移平均速率及迁移效率。而转染了组成型激活突变体的实验组与其对照相比则能显著提升C17．2的迁移平均速率，转染显性阴性突变体的实验组与其对照相比C17．2细胞的迁移平均速率显著下降，然而两者的FMI与对照组相比仍无显著变化。 以上结果说明Rac1—GTP才是Rac1调节细胞迁移的活性形式，仅仅上调或下调Rac1的表达水平并不足以显著改变C17．2神经干细胞系的平均迁移速率，而通过改变C17．2细胞内Rac1的活性状态则能显著改变C17．2神经干细胞系的平均迁移速率。此外，FMI是细胞定向迁移水平的指标，在无外在诱导物刺激的情况下，无论改变Rac1表达水平或活性状态均不能显著改变C17．2细胞迁移的效率。上述结论初步揭示了Rac1在NSCs迁移中的作用，为进一步研究Rac1在胶质瘤条件培养基或其他趋化因子、生长因子诱导NSCs定向迁移的中的作用建立好了实验模型，为更好的利用NSCs作为胶质瘤基因治疗的载体提供了一定的实验依据。