研究目的：急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)的重要标志是严重的髓系分化障碍,因此诱导分化治疗是目前临床上针对AML的有效治疗策略。全反式维甲酸(All-trans retinoic acid, ATRA)是临床上首个用于治疗急性早幼粒白血病(Acute promeyloid leukemia, APL)的诱导分化剂,虽然治疗初期疗效显著,然而随着ATRA的使用,APL患者出现了不同程度的不良反应并对ATRA产生了耐受作用。因此,寻找新的高效低毒的诱导分化剂显得尤为重要。酪氨酸激酶抑制剂近年来引起了学者们的广泛关注和探讨,其中多个药物均被证实可以诱导AML细胞的分化。达沙替尼(Dasatinib)是第二代的小分子酪氨酸激酶抑制剂,已有研究表明Dasatinib可以协同ATRA诱导AML细胞的分化,然而有关Dasatinib单独诱导AML细胞的分化作用及其分子机制却很少有被报道。有文献报道,STAT1在细胞随性分化过程中发挥着关键作用,但是,关于STAT1在Dasatinib诱导AML细胞分化中的作用并未见文献报道。同时,我们在实验过程中观察到了Dasatinib可以诱导AML细胞发生自噬,已有研究表明细胞自噬可以影响细胞分化过程,然而AML细胞中自噬的发生与细胞分化之间的关系却未见报道。因此,本课题拟通过实验方法研究Dasatinib诱导AML细胞的分化作用,并且进一步探索可能存在的分子机制。研究方法：选用人白血病细胞株HL60和NB4为研究对象,考察Dasatinib对AML细胞的增殖和周期分布的影响,并检测Dasatinib诱导AML细胞分化的能力。采用台盼兰拒染法结合血细胞计数板计数来观察细胞增殖情况,描绘细胞生长曲线；细胞经Annexin V-PI双染后采用流式细胞术检测细胞凋亡情况；细胞经PI染色后采用流式细胞术分析细胞周期的变化情况；细胞经CD11b-PE抗体结合后采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b表达；应用Western blot检测细胞凋亡、周期和分化相关蛋白(PARP、Caspase3、Cleaved-Caspase3、c-Myc、p21、p27、 PU.1、C/EBPβ)的表达；应用硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验检测细胞分化能力；应用瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学改变；应用Real-time PCR检测细胞内分化相关因子(PU.1、C/EBPα、C/EBPβ)的mRNA表达水平；建立人白血病裸小鼠移植瘤模型评价Dasatinib的体内药效；选用人白血病细胞株HL60和NB4为研究对象,考察Dasatinib诱导AML细胞分化的分子机制。细胞经CDllb-PE抗体结合后采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b表达；细胞经PI染色后采用流式细胞术分析细胞周期的变化情况；应用NBT还原实验检测细胞分化能力；应用瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学改变；应用Western blot检测蛋白(PU.1、p-STAT1(S727)、p38、p-p38、JNK、 p-JNK、RARa、p-STAT1(Y701)、STAT1、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、AKT、 p-AKT、LC3)的表达；应用Real-time PCR检测细胞内CXCL-10、RIG-G、IRF-1的mRNA表达水平；应用免疫荧光法检测细胞内STAT1的定位变化；应用荧光素酶报告基因系统检测细胞内RARa的转录活性；应用丹酰戊二胺(MDC)染色方法检测细胞内自噬泡的分布情况。研究结果：1)通过台盼兰拒染法结合血细胞计数板计数,显示Dasatinib能显著抑制HL60细胞的增殖,并且呈现一定的浓度依赖性和时间依赖性。采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,并用western blot法检测凋亡相关蛋白表达水平,结果显示,高浓度Dasatinib均能引起HL60细胞(30μM)和NB4(20μM)细胞的凋亡。流式细胞术分析细胞周期情况,显示Dasatinib能使HL60细胞和NB4细胞的细胞周期阻滞在G1/G0期。人白血病裸小鼠移植瘤模型评价Dasatinib的体内药效,结果显示,Dasatinib对AML细胞的体内增殖具有较好的抑制作用。2)检测细胞分化表面抗原标记物CDllb的表达,结果显示Dasatinib能够诱导HL60和NB4细胞发生分化,且呈时间和浓度依赖性关系,Dasatinib (10μM作用HL60细胞72小时后,CD11b阳性率为48%,Dasatinib (5μM)作用NB4细胞48小时后,CD11b阳性率达到了49%。瑞氏-吉姆萨的染色结果表明Dasatinib作用72小时后,HL60细胞和NB4细胞发生了髓系细胞方向的分化。NBT还原实验结果确证了Dasatinib诱导HL60细胞分化的能力。Real-time PCR以及western blot实验结果进一步证实了Dasatinib可以激活AML细胞中髓性分化相关因子的转录。以上这些实验结果都表明Dasatinib可以诱导AML细胞发生髓性分化。3) Western blot结果表明Dasatinib作用后AML细胞中RARa的蛋白表达水平随时间进程明显下降。采用荧光素酶报告基因系统检测RARa荧光素酶活性,显示Dasatinib并不能激活RARa的转录。采用shRNA技术沉默HL60细胞中RARa蛋白的表达,将Dasatinib分别作用转入了空载的HL60细胞和沉默了RARa的HL60细胞72小时,流式细胞术检测CD11b结果表明,Dasatinib诱导这两株细胞分化的能力没有发生改变。以上结果提示我们RARa在Dasatinib诱导的AML细胞的分化过程中可能没有发挥主要作用。4) Dasatinib作用HL60和NB4细胞不同时间后,STAT1蛋白的磷酸化水平被明显上调。DAPI染色结合免疫荧光定位结果显示,STAT1被磷酸化激活后由细胞质进入细胞核中,采用Real-time PCR检测STAT1下游因子CXCL-10、 RIG-G、 IRF-1的mRNA转录水平,结果证实STAT1发挥了转录调控作用。采用shRNA技术沉默HL60细胞中STAT1蛋白的表达,沉默后的HL60细胞经Dasatinib作用72小时后,CDllb阳性率由54%降到了39%,表明Dasatinib诱导的HL60细胞的分化被抑制,NBT还原实验和瑞氏-吉姆萨染色实验均证实了这一结果。Western blot结果显示,在Dasatinib诱导AML细胞分化的过程中,MEK/ERK蛋白的磷酸化水平明显上调。采用MEK抑制剂PD98059和Dasatinib共同作用AML细胞后(10μM Dasatinib作用HL60细胞72小时,5μM Dasatinib作用NB4细胞48小时),细胞内STAT1蛋白的磷酸化水平被明显下调,同时,流式细胞术检测CDllb的表达,结果显示HL60细胞中CDllb阳性率由单用Dasatinib的50%下降到了合用组的16%,NB4细胞中CDllb阳性率由单用Dasatinib的57%下降到了合用组的12%。以上结果提示我们,Dasatinib诱导的AML细胞的分化作用依赖于MEK/ERK通路调控的STAT1活性的增加。5) Dasatinib作用HL60和NB4细胞0、6、12、24和48小时后,采用western blot检测了自噬标记蛋白LC3的变化,结果表明LC3Ⅱ蛋白表达随时间逐渐增加,光密度分析显示LC3Ⅱ/Ⅰ比值逐渐升高,作用48小时后差异显著。采用MDC染色检测细胞内自噬泡的产生和分布,结果表明,不论是HL60细胞还是NB4细胞中,Dasatinib作用6小时后,部分细胞内即出现示踪自噬泡的荧光点状分布,作用12小时后细胞核周围区域大量出现点状荧光分布,到24小时后更加明显。通过自噬抑制剂3MA、 Wortmannin和LY294002来下调AML细胞中的自噬水平,流式细胞术检测CDllb结果表明,Dasatinib诱导的AML细胞的分化也因此被抑制。相应地,通过自噬促进剂雷帕霉素(Rapamycin)来增加AML细胞中的自噬水平,Dasatinib诱导的AML细胞的分化水平则被明显上调。将较低浓度的Dasatinib和ATRA同时作用于HL60和NB4细胞,流式细胞术检测CD11b结果表明,Dasatinib能显著促进ATRA诱导的AML细胞的分化。采用MDC染色观察自噬泡的形成,结果显示在HL60和NB4细胞中,Dasatinib和ATRA共同作用的组别自噬泡大量出现并分散在细胞核周区域,由此可见,自噬可能参与了Dasatinib协同ATRA诱导AML细胞分化的过程。以上实验表明,Dasatinib可以诱导AML细胞发生自噬,这种自噬的发生伴随着整个髓性分化进程而存在,同时这种自噬的发生有利于AML细胞的分化。结论：本论文较为系统地讨论了Dasatinib诱导的AML细胞的分化作用,并对其中的分子机制做了初步探讨。研究表明Dasatinib可以诱导AML细胞分化成为髓系细胞,并且MEK/ERK依赖性的STAT1的激活以及细胞内自噬水平的上调都可能有利于分化进程。本课题对Dasatinib诱导AML细胞分化的分子机制作了全新阐述,为Dasatinib在分化诱导治疗上的应用提供了实验依据,也为进一步完善和发展新型的白血病分化诱导治疗策略提供了理论基础。