论文部分内容阅读
目的探讨HHcy与脂代谢相关基因ERO1α mRNA和蛋白表达的改变，以及ERO1αDNA甲基化在引起ApoE-/-鼠肝脏脂代谢紊乱形成过程中的作用，明确HHcy在ApoE-/-鼠脂代谢紊乱形成中对ERO1α表达及其DNA甲基化调控的影响。方法采用油红O染色法检测各组小鼠肝脏脂质沉积情况，酶标仪检测各组小鼠肝脏内TC和TG含量的变化，采用荧光定量PCR（RT-PCR）和Western blot法检测ERO1αmRNA和蛋白的表达；采用巢式降落式PCR（ntMS-PCR）法检测ERO1α基因DNA甲基化改变，以ELISA法测各组小鼠肝脏内DNMT1含量的变化。构建ERO1α和DNMT1的重组表达质粒及siRNA并转染肝细胞，以RT-PCR法测ERO1α和DNMT1的mRNA表达的变化，以Western blot测ERO1α和DNMT1蛋白表达的变化，以巢式降落式PCR测ERO1α基因甲基化修饰状态的改变。结果HHcy组小鼠肝脏脂质面积和血脂水平显著高于对照组与干预组（P<0.01），与对照组比较，其肝脏脂质面积和血脂TC、TG分别升高约4.53、2.21、2.86倍，相关性分析结果显示，TC与其血清Hcy水平呈正相关（r2=0.1029，P<0.01），TG与血清Hcy水平呈正相关（r2=0.1216，P<0.05）。荧光RT-PCR结果显示，与对照组相比，ApoE-/-对照组、HHcy组和干预组ERO1α的表达分别下降至76.66％，20.43％和40.14％，差异有统计学意义（P<0.01）。干预组与HHcy组相比，ERO1α表达升高1.96倍，差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测结果显示Hcy对ERO1α蛋白表达与对mRNA表达的影响是一致的。细胞水平上，与对照组比较，用50，100，200，500μmol/L Hcy刺激细胞，ERO1α的mRNA表达分别下降至90.37％，55.44％，46.88％，36.93％，差异有统计学意义（P<0.01），叶酸治疗组与100μmol/L Hcy组比较，ERO1α的mRNA表达升高1.81倍，差异有统计学意义（P<0.05）。 Western blot检测结果显示Hcy对ERO1α蛋白表达与对mRNA表达的影响一致。构建ERO1α的重组质粒并转染肝细胞后检测ERO1α的mRNA和蛋白表达，结果显示，与对照组比较，EGFP-N1组ERO1α的mRNA水平无明显变化，而EGFP-N1-ERO1α组的mRNA水平增加至1.33倍，差异有统计学意义（P<0.01），Western blot检测结果显示ERO1α蛋白表达与mRNA表达一致。构建针对ERO1α的干扰片段（siRNA1，siRNA2，siRNA3）并分别转染肝细胞，检测ERO1α的mRNA和蛋白表达，结果显示，与对照组比较，各组ERO1α的mRNA水平分别降至61.06％，38.70％和69.41％，差异有统计学意义（P<0.01），其中siRNA2干扰效果最显著，Western blot检测结果显示ERO1α蛋白表达与mRNA表达一致。细胞内TC和TG检测结果显示，与对照组比较， Hcy+EGFP-N1-ERO1α组分别下降至51.52％（P<0.05）和60.89％（P<0.01），而同时siRNA2组分别增加至1.39倍（P<0.05）和1.88倍（P<0.01）。启动子活性分析的结果显示，人类ERO1α的核心启动子存在活性，-1~-1100bp段的启动活性最强，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)， ntMS-PCR法检测ERO1α基因启动子区DNA甲基化，结果表明，与对照组相比，HHcy组和治疗组的ERO1α基因启动子区DNA甲基化程度分别提高1.65倍和1.42倍，差异有统计学意义(P<0.01)，干预组可以与HHcy组相比，ERO1α基因启动子区DNA甲基化程度下降至86.13％，差异有统计学意义（P<0.01)。构建DNMT1的重组质粒及针对DNMT1的siRNA并转染肝细胞，检测DNMT1的mRNA和蛋白表达。结果显示，与对照组比较，EGFP-N1-DNMT1组DNMT1的mRNA的表达增加至1.55倍，差异有统计学意义（P<0.01），siRNA组DNMT1的mRNA的表达下降至26.70％，差异有统计学意义（P<0.01），且Western blot检测结果显示ERO1α蛋白表达与mRNA表达一致。检测转染后各组细胞ERO1α甲基化水平，结果显示，与对照组比较，EGFP-N1-DNMT1的ERO1α甲基化水平增加至1.31倍，siRNA组下降至72.34%，差异有统计学意义（P<0.01）。结论1. HHcy通过ERS导致小鼠肝脏脂质代谢紊乱。2. ERO1α在HHcy调控肝脏脂代谢中起重要作用。3. Hcy可能通过调控ERO1α DNA甲基化影响肝脏脂代谢。4. DNMT1可能在Hcy调控ERO1α DNA甲基化过程中起重要作用。