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研究背景与目的：近年来，随着肠脑轴研究的不断深入，有越来越多的证据显示肠道菌群失调与抑郁症的发生密切相关。部分研究显示益生元、益生菌干预对抑郁症治疗有效，但肠道菌群具体作用的相关分子机制研究较少。五羟色胺(5-HT)作为一种神经递质，被证实与抑郁症密切相关，此外，抑郁症会出现免疫系统失调和炎症因子过表达状态。有研究表明肠道菌群可能与5-HT代谢有关，并且与肠道免疫反应及炎症因子水平密切相关。为探究抑郁症与肠道菌群失调相关的分子机制，及益生元、益生菌对抑郁症肠道菌群结构及丰度的影响，尤其是对5-HT代谢及免疫炎症反应的影响，设计并开展本研究。
方法：
选择20只雄性成年Wistar大鼠，随机分为对照组与实验组，实验组采用慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)干预3周建立抑郁模型。实验过程中监测体重变化，并进行抑郁样行为学检测，即蔗糖偏好测试(SPT)、强迫游泳测试(FST)。采用16SrDNA基因测序分析结肠粪便菌群结构及丰度变化，明确组间差异性物种；ELASA法测定血清多巴胺、IL-6、IL-1β、TNF-α、血清及结肠5-HT的水平；PCR测定结肠TPH1及IDOmRNA表达；流式细胞测定CD3+、CD4+、CD8+细胞数以及CD4+/CD8+比值；高效液相色谱-质谱连用分析(HPLC-MS)法测定前额叶、海马5-HT含量；Westernblot测定前额叶、海马TPH2、IDO蛋白表达。
选择40只雄性成年Wistar大鼠，随机分为CUMS组及FOS/GOS、BL、Lr组，CUMS干预同时各组分别灌注生理盐水、低聚果糖/低聚半乳糖(FOS/GOS)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，检测指标大部分同前。为明确结肠5-HT含量的改变是否与结肠嗜铬粒蛋白(CgA)细胞增殖有关，增加免疫荧光染色(双染+核染)检测，分析嗜铬粒蛋白CgA+cell与5-HT+cell的变化。
结果：
CUMS干预后实验组大鼠体重较对照组明显降低，出现抑郁样行为改变，SPT检测糖水偏好程度降低，FST检测相对静止时间较长。16SrDNA基因测序显示两组大鼠肠道菌群在各分类水平(Phylum、Class、Order、Family、Genus)均有显著差异性物种，LEfSe分析结果显示对照组的优势物种有拟杆菌门(Bacteroidetes)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、拟杆菌目(Bacteroidales)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、普雷沃氏菌属(Prevotellaceae_NK3B31_group)。CUMS干预的优势物种有厚壁菌门(Firmicutes )、梭菌纲(Clostridia )、梭菌目(Clostridiales )、肠杆菌目(Enterobacteriales)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae )、埃希氏_志贺杆菌属(Escherichia_shigella)、大肠埃希氏菌种(Escherichia_coli)。ELISA检测结果外周血多巴胺、5-HT的含量并无显著性差异(P>0.05)，而结肠组织5-HT的含量组间有显著性差异(t=6.36；P<0.05)。CUMS组结肠5-HT含量较多，相应的TPH1/GAPDHmRNA的表达明显高于对照组，而SCL6A4/GAPDHmRNA的表达明显低于对照组。两组大鼠前额叶与海马组织中的5-HT含量组间均有显著性差异(P<0.05)，CUMS组前额叶和海马组织中5-HT的含量均较少，TPH2的含量均明显低于对照组，而IDO的含量明显高于对照组。外周血ELISA检测炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量，组间均有显著性差异(P<0.05)，CUMS组IL-6、IL-1β、TNF-α的含量均高于对照组。流式细胞术检测CD3+CD4+双阳性细胞比例、CD4+/CD8+比值CUMS组均低于对照组，CD3+CD8+双阳性细胞比例高于对照组。
CUMS干预同时灌注FOS/GOS、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌后，各组体重出现不同程度的增长加快，Lr组实验前后体重增长值最高；SPT、FST抑郁样行为检测结果显示组间有显著差异(P<0.05)，Lr组行为改善效果最为显著。16SrDNA基因测序显示组间物种分布多样性和均匀度有显著差异，Lr组的物种相对比较集中；主成分分析(PCA)结果显示Lr组与CUMS组距离最远，说明组间群落组成差异最大；LEfSe分析结果显示CUMS组的优势物种大多数与之前相同，新增了毛螺菌科(Lachnospiraceae )、毛螺菌属(Lachnospiraceae_NK4A136_group )、疣微菌科(Ruminococcaceae)、疣微菌属(Ruminococcaceae_UGG_014)；相对于对照组而言，Lr组新增了气单胞菌目(Aeromonadales)、琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)、普雷沃菌属(Prevotella_9 )；FOS/GOS组的优势物种是普雷沃氏菌属(Prevotellaceae_UCG-003)，而BL组缺乏优势物种。各组大鼠血清多巴胺、5-HT含量仍无显著差异，而结肠组织5-HT含量有显著性差异(F=33.861；P<0.05)，CUMS组结肠5-HT含量最高，TPH1/GAPDHmRNA表达最高，SCL6A4/GAPDHmRNA表达较低，而Lr组呈现与之相反的改变。免疫荧光检测显示CgA+cell组间无明显性差异(P>0.05)，5-HT含量与5-HT+Cell/mm2计数呈显著正相关(r=0.897,P<0.05)。前额叶与海马组织中的5-HT、TPH2及IDO含量组间均有显著性差异(P<0.05)，CUMS组5-HT、TPH2最少，而Lr组含量最多；CUMS组IDO含量最多，而Lr组含量最少。血炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量与免疫细胞CD4+、CD8+细胞比例及CD4+/CD8+比值，组间均有显著性差异(P<0.05)。CUMS组炎症因子含量最多，CD4+/CD8+比值最小，而Lr组炎症因子含量最少，CD4+/CD8+比值最大。Pearson相关分析显示结肠组织的5-HT、TPH1/GAPDHmRNA、5-HT+cell、5-HT+cell/CgA+cell比值与前额叶及海马组织的5-HT、TPH2、TH呈显著负相关，与前额叶IDO呈显著正相关；结肠组织SCL6A4/GAPDHmRNA与前额叶及海马5-HT、TPH2、TH呈显著正相关，与前额叶IDO呈显著负相关。CUMS干预的优势物种厚壁菌门(Firmicutes)、梭菌纲(Clostridia)、梭菌目(Clostridiales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)与前额叶及海马组织5-HT、TPH2、TH、结肠SCL6A4/GAPDHmRNA、CD3+CD4+双阳性细胞比例、CD4+/CD8+比值呈显著负相关，与前额叶IDO、结肠组织5-HT、TPH1/GAPDHmRNA、5-HT+cell、5-HT+cell/CgA+cell、血炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α呈显著正相关。Lr组的优势物种拟杆菌门(Bacteroidetes )、拟杆菌纲(Bacteroidia)、拟杆菌目(Bacteroidales)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)与前额叶及海马组织5-HT、TPH2、TH、结肠SCL6A4/GAPDHmRNA、血CD3+CD4+双阳性细胞比例、CD4+/CD8+比值呈显著正相关，与前额叶IDO、结肠组织5-HT、TPH1/GAPDHmRNA、5-HT+cell、5-HT+cell/CgA+cell、血炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α呈显著负相关；毛螺菌科(Lachnospiraceae)、疣微菌科(Ruminococcaceae)、普雷沃菌属(Prevotella_9、Prevotellaceae_NK3B31_group、Prevotellaceae_UCG-003)与上述检测指标也呈现出不同程度的相关性。
结论：
抑郁症的发生与肠道菌群紊乱、5-HT代谢改变和免疫炎症反应之间存在紧密联系。肠道菌群可能作为一种关键因素，远程调节大脑的情绪和行为改变，影响抑郁症的发生发展。
益生元、益生菌可以调节肠道菌群结构，会导致某些菌群丰度减少，例如促肠道5-HT合成的细菌(Clostridiales等)及促炎细菌(Escherichiashigella等)，同时也会导致某些菌群丰度增加，例如产短链脂肪酸(SCFA)的细菌(Prevotellaceae等)。这些改变的肠道菌群可以调节结肠及脑组织5-HT代谢，并且可以调节免疫炎症反应，发挥抗抑郁作用。综合分析，鼠李糖乳杆菌的抗抑郁作用最为显著，提示其在抗抑郁治疗方面有潜在的应用价值。
方法：
选择20只雄性成年Wistar大鼠，随机分为对照组与实验组，实验组采用慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)干预3周建立抑郁模型。实验过程中监测体重变化，并进行抑郁样行为学检测，即蔗糖偏好测试(SPT)、强迫游泳测试(FST)。采用16SrDNA基因测序分析结肠粪便菌群结构及丰度变化，明确组间差异性物种；ELASA法测定血清多巴胺、IL-6、IL-1β、TNF-α、血清及结肠5-HT的水平；PCR测定结肠TPH1及IDOmRNA表达；流式细胞测定CD3+、CD4+、CD8+细胞数以及CD4+/CD8+比值；高效液相色谱-质谱连用分析(HPLC-MS)法测定前额叶、海马5-HT含量；Westernblot测定前额叶、海马TPH2、IDO蛋白表达。
选择40只雄性成年Wistar大鼠，随机分为CUMS组及FOS/GOS、BL、Lr组，CUMS干预同时各组分别灌注生理盐水、低聚果糖/低聚半乳糖(FOS/GOS)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，检测指标大部分同前。为明确结肠5-HT含量的改变是否与结肠嗜铬粒蛋白(CgA)细胞增殖有关，增加免疫荧光染色(双染+核染)检测，分析嗜铬粒蛋白CgA+cell与5-HT+cell的变化。
结果：
CUMS干预后实验组大鼠体重较对照组明显降低，出现抑郁样行为改变，SPT检测糖水偏好程度降低，FST检测相对静止时间较长。16SrDNA基因测序显示两组大鼠肠道菌群在各分类水平(Phylum、Class、Order、Family、Genus)均有显著差异性物种，LEfSe分析结果显示对照组的优势物种有拟杆菌门(Bacteroidetes)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、拟杆菌目(Bacteroidales)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、普雷沃氏菌属(Prevotellaceae_NK3B31_group)。CUMS干预的优势物种有厚壁菌门(Firmicutes )、梭菌纲(Clostridia )、梭菌目(Clostridiales )、肠杆菌目(Enterobacteriales)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae )、埃希氏_志贺杆菌属(Escherichia_shigella)、大肠埃希氏菌种(Escherichia_coli)。ELISA检测结果外周血多巴胺、5-HT的含量并无显著性差异(P>0.05)，而结肠组织5-HT的含量组间有显著性差异(t=6.36；P<0.05)。CUMS组结肠5-HT含量较多，相应的TPH1/GAPDHmRNA的表达明显高于对照组，而SCL6A4/GAPDHmRNA的表达明显低于对照组。两组大鼠前额叶与海马组织中的5-HT含量组间均有显著性差异(P<0.05)，CUMS组前额叶和海马组织中5-HT的含量均较少，TPH2的含量均明显低于对照组，而IDO的含量明显高于对照组。外周血ELISA检测炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量，组间均有显著性差异(P<0.05)，CUMS组IL-6、IL-1β、TNF-α的含量均高于对照组。流式细胞术检测CD3+CD4+双阳性细胞比例、CD4+/CD8+比值CUMS组均低于对照组，CD3+CD8+双阳性细胞比例高于对照组。
CUMS干预同时灌注FOS/GOS、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌后，各组体重出现不同程度的增长加快，Lr组实验前后体重增长值最高；SPT、FST抑郁样行为检测结果显示组间有显著差异(P<0.05)，Lr组行为改善效果最为显著。16SrDNA基因测序显示组间物种分布多样性和均匀度有显著差异，Lr组的物种相对比较集中；主成分分析(PCA)结果显示Lr组与CUMS组距离最远，说明组间群落组成差异最大；LEfSe分析结果显示CUMS组的优势物种大多数与之前相同，新增了毛螺菌科(Lachnospiraceae )、毛螺菌属(Lachnospiraceae_NK4A136_group )、疣微菌科(Ruminococcaceae)、疣微菌属(Ruminococcaceae_UGG_014)；相对于对照组而言，Lr组新增了气单胞菌目(Aeromonadales)、琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)、普雷沃菌属(Prevotella_9 )；FOS/GOS组的优势物种是普雷沃氏菌属(Prevotellaceae_UCG-003)，而BL组缺乏优势物种。各组大鼠血清多巴胺、5-HT含量仍无显著差异，而结肠组织5-HT含量有显著性差异(F=33.861；P<0.05)，CUMS组结肠5-HT含量最高，TPH1/GAPDHmRNA表达最高，SCL6A4/GAPDHmRNA表达较低，而Lr组呈现与之相反的改变。免疫荧光检测显示CgA+cell组间无明显性差异(P>0.05)，5-HT含量与5-HT+Cell/mm2计数呈显著正相关(r=0.897,P<0.05)。前额叶与海马组织中的5-HT、TPH2及IDO含量组间均有显著性差异(P<0.05)，CUMS组5-HT、TPH2最少，而Lr组含量最多；CUMS组IDO含量最多，而Lr组含量最少。血炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量与免疫细胞CD4+、CD8+细胞比例及CD4+/CD8+比值，组间均有显著性差异(P<0.05)。CUMS组炎症因子含量最多，CD4+/CD8+比值最小，而Lr组炎症因子含量最少，CD4+/CD8+比值最大。Pearson相关分析显示结肠组织的5-HT、TPH1/GAPDHmRNA、5-HT+cell、5-HT+cell/CgA+cell比值与前额叶及海马组织的5-HT、TPH2、TH呈显著负相关，与前额叶IDO呈显著正相关；结肠组织SCL6A4/GAPDHmRNA与前额叶及海马5-HT、TPH2、TH呈显著正相关，与前额叶IDO呈显著负相关。CUMS干预的优势物种厚壁菌门(Firmicutes)、梭菌纲(Clostridia)、梭菌目(Clostridiales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)与前额叶及海马组织5-HT、TPH2、TH、结肠SCL6A4/GAPDHmRNA、CD3+CD4+双阳性细胞比例、CD4+/CD8+比值呈显著负相关，与前额叶IDO、结肠组织5-HT、TPH1/GAPDHmRNA、5-HT+cell、5-HT+cell/CgA+cell、血炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α呈显著正相关。Lr组的优势物种拟杆菌门(Bacteroidetes )、拟杆菌纲(Bacteroidia)、拟杆菌目(Bacteroidales)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)与前额叶及海马组织5-HT、TPH2、TH、结肠SCL6A4/GAPDHmRNA、血CD3+CD4+双阳性细胞比例、CD4+/CD8+比值呈显著正相关，与前额叶IDO、结肠组织5-HT、TPH1/GAPDHmRNA、5-HT+cell、5-HT+cell/CgA+cell、血炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α呈显著负相关；毛螺菌科(Lachnospiraceae)、疣微菌科(Ruminococcaceae)、普雷沃菌属(Prevotella_9、Prevotellaceae_NK3B31_group、Prevotellaceae_UCG-003)与上述检测指标也呈现出不同程度的相关性。
结论：
抑郁症的发生与肠道菌群紊乱、5-HT代谢改变和免疫炎症反应之间存在紧密联系。肠道菌群可能作为一种关键因素，远程调节大脑的情绪和行为改变，影响抑郁症的发生发展。
益生元、益生菌可以调节肠道菌群结构，会导致某些菌群丰度减少，例如促肠道5-HT合成的细菌(Clostridiales等)及促炎细菌(Escherichiashigella等)，同时也会导致某些菌群丰度增加，例如产短链脂肪酸(SCFA)的细菌(Prevotellaceae等)。这些改变的肠道菌群可以调节结肠及脑组织5-HT代谢，并且可以调节免疫炎症反应，发挥抗抑郁作用。综合分析，鼠李糖乳杆菌的抗抑郁作用最为显著，提示其在抗抑郁治疗方面有潜在的应用价值。