研究背景和意义：　　青光眼是一种以视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）丢失、视神经损害、视野缺损为特征的视网膜神经变性疾病，RGCs 一旦发生变性，难以逆转，如何预防及逆转RGCs变性，长期以来都是青光眼治疗面临的难题。青光眼是世界上第二大致盲眼病，其发病机制复杂，目前尚不十分明确。高眼压是目前唯一公认导致青光眼的危险因素之一[1]，但高眼压并非青光眼的充分必要因素，临床上许多患者从未出现眼压升高或者即使有眼压升高控制良好，然而其RGCs丢失、视神经损害和视野缺损仍然持续加重，最终导致视神经萎缩、视功能完全丧失[2]。研究表明，缺血、缺氧、谷氨酸兴奋性毒性、神经营养因子缺乏、氧化应激等均会导致青光眼RGCs变性凋亡[2, 3]。研究表明谷氨酸兴奋性毒性导致RGCs变性的动物模型更能代表青光眼的病理损伤机制[2, 4, 5]。　　空泡分选蛋白35（vacuolar protein sorting 35，Vps35）是Retromer复合体的核心组分，负责分选识别膜蛋白受体并将其从内体转运至反式高尔基体（ trans-Golgi network，TGN）或者质膜，避免其被溶酶体降解[6]。大量研究显示Vps35与中枢神经系统变性疾病，如阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）[7,8]和帕金森氏病（Parkinson’s disease, PD）[9-11]关系密切。Tau蛋白是表达在神经细胞轴突中的主要微管相关蛋白，tau蛋白过度磷酸化（hyperphosphorylation）增加可以导致其与微管蛋白结合力降低、影响微管的稳定性，进而影响轴突运输，已经证实过度磷酸化 tau 蛋白（p-tau）与多种神经变性疾病相关，如 AD、家族性额颞叶痴呆等[12]。视网膜有“外周脑”之称，被认为是中枢神经系统的一部分，在正常视网膜中 tau 蛋白广泛表达，而p-tau几乎不表达。青光眼的视网膜神经改变与AD等中枢变性类疾病类似：与年龄增加相关；都以神经元变性为特征；脑内和视网膜均有 p-tau 表达[13-16]。本课题组前期研究中已经发现Vps35主要表达在RGCs，Vps35缺陷导致RGCs凋亡增加、胞体排列紊乱、突起减少、视网膜神经纤维层变薄等神经变性样改变，而且视网膜 p-tau表达增加[17]。那么我们推测Vps35减少导致视网膜神经节细胞变性与p-tau增加有关。　　细胞周期素依赖蛋白激酶5（CDK5）是有丝分裂后神经元活动的重要调节器，对中枢神经元的细胞构筑、细胞的迁移和分化、细胞骨架形成、轴突导向、突触可塑性等都有重要作用，而且可以调控细胞凋亡信号[18]。近年的研究普遍认为 CDK5 是 tau蛋白过度磷酸化病理机制中的主要致病激酶。CDK5 介导的tau蛋白过度磷酸化增强所引起的神经细胞微管结构异常，细胞骨架塌陷被认为是其导致细胞凋亡的主要病理机制。而且有研究证实CDK5/p35活性增强可以导致视网膜神经节细胞凋亡增加[19]。因此我们推测Vps35减少可能增加Cdk5/p35激酶活性导致视网膜p-tau表达增加。　　研究目标：　　本研究的目的在于：在前期研究发现 Vps35 减少导致视网膜神经节细胞变性及p-tau 表达增加的基础上探索 Vps35 在视网膜神经节细胞变性中的机制；阐明 Vps35通过调节CDK5/p35蛋白降解而抑制其活性，进而下调p-tau表达，阻止RGCs变性的分子机制。　　研究方法：　　1. 大鼠玻璃体腔注射谷氨酸20nmoles，50nmoles和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA） 40nmoles，注药后不同时间点抽取玻璃体液检测谷氨酸浓度；取不同时间点的眼球行石蜡切片免疫组化、免疫荧光及 TUNEL 检测神经节细胞层（GCL）细胞数、视网膜厚度、凋亡细胞；取各时间点新鲜视网膜检测凋亡相关蛋白 cleaved-caspase-3 和磷酸化tau s396及taus404的表达情况。探索玻璃体腔注药建立大鼠谷氨酸兴奋性毒性相关视网膜神经变性动物模型的有效剂量。　　2. 利用筛选出的大鼠谷氨酸视网膜兴奋性毒性模型，取不同时间点的视网膜新鲜组织标本或者取眼球制作石蜡切片，采用免疫荧光、免疫印迹、Q-PCR及免疫共沉淀等技术研究Vps35、CDK5/p35、p-tau s396、溶酶体关联膜蛋白（LAMP1）、早期内体抗原（EEA1）在谷氨酸兴奋性毒性模型中的表达、变化趋势及相互作用。　　3. 利用原代培养的视网膜神经节细胞，结合细胞转染技术，利用免疫荧光、免疫印迹、免疫共沉淀及Q-PCR探索Vps35减少可能通过影响CDK5/p35溶酶体途径降解导致p-tau 表达增加。　　研究结果：　　1. 大鼠玻璃体腔注射谷氨酸 50nmoles 导致视网膜变薄、RGCs 凋亡增加、凋亡相关蛋白（cleaved-caspase-3）、p-tau s396表达明显增加，可以有效的建立谷氨酸兴奋性相关的视网膜神经变性模型。　　2.Vps35下调可以增加CDK5/p35活性，导致p-tau s396和s404表达量增加，抑制CDK5可以明显减少Vps35下调引起的p-tau s396表达增加；Vps35和p35、CDK5和p35存在相互作用。Vps35下调可以减少 LAMP1、EEA1表达，LAMP1与p35， Vps35与LAMP1存在相互作用；Vps35缺乏导致转运到溶酶体降解的CDK5/p35减少，胞内CDK5/p35活性增强，进而导致p-tau增多。　　研究结论：　　本研究中，我们通过大鼠谷氨酸兴奋性毒性相关视网膜神经变性动物模型，利用免疫印迹、免疫共沉淀、免疫组化、免疫荧光、TUNEL检测、Q-PCR、原代细胞培养及细胞转染等技术，探讨了Vps35调控CDK5/p35活性引起视网膜神经节细胞变性的机制。本研究证实了Vps35减少会增强CDK5/p35激酶活性，导致过度磷酸化tau蛋白增加，进而导致视网膜神经节细胞变性；进一步研究发现， Vps35 是通过影响CDK5/p35的溶酶体降解途径进而影响其活性的。本研究揭示了CDK5/p35作为Vps35转运“货物（cargo）”的可能性，使我们对蛋白激酶活化造成过度磷酸化tau蛋白增加而导致RGCs变性的发病机制有了新的认识，有利于从调控Vps35的角度为青光眼等神经变性疾病的预防和临床治疗提供新思路。