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目的:利用蛋白质组学方法建立宫颈癌组织及其癌旁非癌宫颈组织的差异蛋白表达谱。旨在寻找与宫颈癌发生、发展密切相关的蛋白质。
方法:
1.选取因宫颈癌行宫颈癌根治术患者的宫颈癌组织和配对癌旁非癌宫颈组织10例;
2.18cm、pH3-10非线性的IPG胶条进行第一相等电聚焦,12%的SDS-PAGE进行第二向电泳分离,电泳后的凝胶用银染进行染色;
3.用ImageMaster5.0分析软件对电泳结果进行数据采集和图像分析,建立宫颈癌组织和癌旁非癌宫颈组织的蛋白质组差异表达图谱:
4.分别筛选宫颈癌组织和癌旁非癌宫颈组织中全蛋白质组中产生稳定、明显差异并经单例蛋白凝胶和混合蛋白凝胶比对证实的蛋白质斑点进行采集,并用特异性的胰蛋白酶消化蛋白质;
5.酶解后的肽段采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDT-TOF-MS)质谱仪进行质谱分析;
6.根据MALDT-TOF-MS肽指纹图谱搜索www.matrixscience.com上的NCBInr.物种human,固定修饰:Carbamidomethyl(C)。可变修饰Gln-pyro-Glu(N-termQ),Oxidation(M)。峰值误差允许范围100ppm。
7.用Westernblot法检测PKC,ZNF217在宫颈癌及癌旁非癌宫颈组织中的表达与否及表达量的差异性。
结果:
1.建立宫颈癌和癌旁非癌宫颈组织的蛋白质差异表达图谱;
2.两者差异点为56个,其中只在宫颈癌中表达的点9个,只在癌旁非癌宫颈组织中表达的点6个,3倍以上量差的差异点41个,其中在宫颈癌组织中表达上调大于3倍的蛋白质点有16个点(P<0.05),在宫颈癌组织中表达下调大于3倍的蛋白质点有25个(P<0.05);
3.在56个差异表达的蛋白点中,31个蛋白点通过质谱分析和数据库的检索得到了初步的鉴定;
4.对PKC,ZNF217蛋白的分析发现,PKC蛋白仅在宫颈癌组织中表达,癌旁非癌宫颈组织中PKC蛋白未见表达,ZNF217在宫颈癌中的表达量多于正常组织。
结论:
1.运用双向凝胶电泳结合质谱分析的方法可以高通量、高分辨率、高灵敏的分离、分析宫颈癌组织中差异表达的蛋白质:
2.筛选到的56个差异表达蛋白质可能与宫颈癌的发生、发展有关:
3.PKC和ZNF217蛋白可能在宫颈癌中的发生发展起关键作用,但其具体的信号转导机制及促瘤途径仍待进一步研究。
4.试验结果为宫颈癌的诊断、药物研究、预后评估带来新的思路和途径。