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鸡传染性贫血（Chicken infectious anemia,CIA）是由鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus,CIAV）引起的,以雏鸡再生障碍性贫血和全身性淋巴组织萎缩为主要特征的免疫抑制病。CIAV主要感染10-14日龄雏鸡,被感染的雏鸡极易发生其他病原继发感染和疫苗免疫失败,从而给养禽业造成巨大经济损失。近年来,我国鸡场中CIAV阳性率逐年升高。根据流行病学调查数据,CIAV已广泛存在于我国的各种类型鸡群中。疫苗免疫是防控该病的重要方式。然而,目前国外使用的CIAV弱毒疫苗毒力较强;虽然已有灭活疫苗、基因工程疫苗的研究报导,但存在生产成本高、保护效果不佳等缺陷。本研究首先对采集自山东省肉鸡鸡群的疑似CIAV病料进行了检测,并对分离到的33株毒株进行了全基因组测序分析;进一步制备了CIAV亚单位疫苗和DNA核酸疫苗,并对两种疫苗联合接种“Prime-boost”免疫策略的保护效果进行了评价。1.山东省部分地区肉鸡源CIAV分离鉴定与全基因组序列分析为了解山东地区肉鸡CIAV感染情况及毒株基因组特征,本研究于2020年1月至2021年9月采集山东省疑似发病的肉鸡组织样本进行PCR检测,结果发现所采集样品的CIAV阳性率为52.05%（38/73）。将阳性病料接种于MDCC-MSB1细胞,成功分离出33株CIAV。随后,对这33株病毒全基因组序列进行了测定和分析。结果表明,33株CIAV全基因组序列同源性为95.7%～99.3%,与Gen Bank参考株的同源性为95.3%～99.3%。33株CIAV的VP1核苷酸序列同源性为95.1%～99.8%,在VP1氨基酸序列共发现了35个氨基酸位点发生了替换。分离株VP1的第394位均为Q,推测这些分离株可能具有较强致病性。通过RDP4软件对可能存在的基因组重组现象进行预测,发现SD2014、SD2009、SD2103和SD2102这四个毒株存在基因重组。上述结果有助于深入了解CIAV流行株的分子流行病学特征和基因演变规律,提示我们有必要加强对CIAV的监测和防控。2.CIAV亚单位疫苗和DNA核酸疫苗的制备与免疫效果检测为制备安全有效的CIAV疫苗、探索高效的免疫方式,本研究首先构建了原核表达质粒pET32-VP1和pET28-VP2,利用大肠杆菌表达系统分别诱导表达VP1重组蛋白和VP2重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot试验验证表明重组蛋白成功表达。将两种蛋白按1:1混合,与弗氏完全佐剂混合后即为亚单位疫苗。随后,将CIAV VP1基因和VP2基因连入pBud CE 4.0双向表达载体,构建同时表达VP1和VP2的真核表达质粒pBud-VP1-VP2。将真核质粒转染到DF-1细胞,Western blot试验证实目的蛋白可以成功进行表达。将pBud-VP1-VP2质粒与脂质体混合后即为DNA核酸疫苗。根据文献报道,亚单位疫苗免疫虽然能刺激产生抗体,但很难诱发机体细胞免疫;核酸疫苗诱发的免疫应答更加全面,但对动物保护效果不佳。据此,我们探索了先接种DNA核酸疫苗、再接种亚单位疫苗的“Prime-boost”免疫方式。将60只1日龄SPF鸡随机分为4组,第1组在1、14日龄免疫DNA核酸疫苗;第2组在1、14日龄免疫亚单位疫苗;第3组在1日龄免疫DNA核酸疫苗、14日龄免疫亚单位疫苗;第4组在1、14日龄免疫空载体质粒。一免后每周采集血清,检测CIAV抗体滴度。结果发现,亚单位疫苗和DNA核酸疫苗均可诱发抗体免疫反应,而且二免2周后DNA-亚单位疫苗联合免疫所诱发的抗体水平最高。为了解疫苗免疫对细胞免疫功能的影响,通过淋巴细胞增殖试验测定各组脾脏淋巴细胞增殖反应。结果显示,三个疫苗免疫组的SI指数均高于对照组,且DNA-亚单位疫苗联合免疫组的SI指数显著高于单独免疫组（P<0.05）。利用VP1重组蛋白刺激各组淋巴细胞并用ELISA方法检测上清中IL-2、IL6和IFN-γ的含量,结果显示,三个疫苗接种组的IL-2、IL-4和IFN-γ水平显著升高（P<0.05）,其中DNA-亚单位疫苗联合免疫组细胞因子表达水平最高。为进一步验证联合免疫的保护效果,进行了动物攻毒保护试验。将75只1日龄SPF鸡随机分为5组,分别为DNA核酸疫苗免疫组、亚单位疫苗免疫组、DNA-亚单位疫苗联合免疫组、攻毒对照组和空白对照组。1～4组在21日龄肌肉注射CIAV SD15野毒株,通过红细胞压积（Hct）、胸腺指数和血浆病毒载量评估疫苗保护效果。结果表明,未免疫CIAV攻毒组的Hct值和胸腺指数显著降低,而免疫组Hct值和胸腺指数均有所恢复,其中联合免疫组恢复最为显著。在攻毒后的第1、2周采血,通过荧光定量PCR方法检测病毒载量。结果显示,除对照组外其余各组均可检测到病毒血症,DNA-亚单位疫苗联合免疫组的病毒载量最低,且阳性个体数最少,表明联合免疫能够起到较好保护作用。本研究显示,DNA核酸疫苗和亚单位疫苗联合免疫策略可以诱导机体产生更高水平的抗体反应和细胞免疫应答,该方式在CIAV疫苗免疫中良好的应用前景。