噻虫啉和烯唑醇残留免疫分析方法的研究

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:t739155593
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以噻虫啉与巯基丙酸反应合成了噻虫啉半抗原,将噻虫啉半抗原与牛血清蛋白(BSA)偶联制备了免疫原,与卵清蛋白(OVA)偶联制备了包被抗原。经紫外光谱分析证明人工抗原偶联成功,计算出免疫原和包被原的结合比分别为12∶1和6∶1。免疫新西兰大白兔制备了抗噻虫啉多克隆抗体。当包被抗原的浓度为4mg/L时,用间接非竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA)测定噻虫啉抗体的效价为1.0×106。  通过对工作浓度、甲醇含量、离子强度、pH值的优化,确定了抗原抗体的最佳反应条件。在最佳优化的条件下(5%甲醇PBS溶液、Na+0.1M、pH5.5),建立了噻虫啉间接竞争ELISA方法。ELISA的灵敏度(IC50值)为0.01mg/L,最低检测限(IC10值)为0.47μg/L,与其他烟碱类杀虫剂没有明显交叉反应,表明建立的ELISA方法对噻虫啉有很高的特异性。在自来水、田水、土壤、梨和番茄样品中添加0.001-1mg/L(mg/kg)的噻虫啉标准品,在水中的平均回收率在81.57%-109.00%之间,在土壤、梨和番茄中的平均回收率在80.33%-118.53%之间,符合农药残留检测的要求。并用HPLC对所建立的方法进行了验证,两种检测方法的检测结果具有很高的相关性,相关系数为R2=0.9863。  建立了噻虫啉时间分辨荧光免疫分析方法。选择铕离子螯合物为标记物,在室温下与羊抗兔抗体反应,制备了Eu3+-羊抗兔抗体。通过对包被原浓度、抗体浓度、甲醇含量、离子强度和pH值等条件进行优化,确定最优条件为含有5%甲醇、0.2MNa+、pH7.5的PBS,并在最优条件下建立了噻虫啉标准曲线。标准曲线为logit(B/B0)=-0.7253logC-1.9548,R2=0.9878,灵敏度IC50为0.002mg/L,最低检测限IC10为2ng/L。与ELISA分析方法相比,TRFIA的灵敏度高出5倍。利用建立的TRFIA方法用于农产品添加回收实验,同时利用HPLC对添加样品进行平行分析。TRFIA测定结果和HPLC测定的结果具有很好的相关性,相关系数为R2=0.9966。说明建立的TRFIA方法能够简单、快速和准确用于噻虫啉的残留分析。  通过对化学发光底物中缓冲液、增强剂中的有机溶剂、发光增强剂的筛选,以及对氧化剂的浓度的优化,配制了具有良好化学发光性能的发光底物溶液。在此基础上,通过对包被原浓度、抗体浓度、封闭物的选择;甲醇含量、离子强度和pH值等条件进行了优化,确定最优条件为:包被原和抗体的浓度分别为1mg/L和5mg/L,2.5%脱脂奶粉为封闭物,最佳工作溶液为含有5%的甲醇、pH5.5、0.4MNa+强度的磷酸盐缓冲溶液。在最优化的条件下,建立了噻虫啉的标曲线。其IC50为0.0018mg/L,最低检测限IC10为O.092μg/L,结果表明建立的ECL-ELISA分析方法的灵敏度比噻虫啉ELISA分析方法高出5倍,同时应用于水样的检测分析,平均回收率为79.2%-88.5%,变异系数在3.71%-9.35%之间。  制备了噻虫啉和氯噻啉酶标半抗原,通过三种不同的直接ECL-ELISA反应模式优化了包被抗体浓度和酶标半抗原浓度。基于制备的酶标半抗原和优化的CLEIA发光底物,建立了噻虫啉和氯噻啉的多残留化学发光酶免疫分析。在番茄、甘蓝、稻米样品中进行添加回收实验来评估单酶标ECL-ELISA和多酶标ECL-ELISA对噻虫啉和氯噻啉的的检测分析。单酶标ECL-ELISA用来测定氯噻啉和噻虫啉农药残留时,平均回收率是84.4%-117%,变异系数是1.0%-7.3%;多酶标ECL-ELISA法检测噻虫啉和氯噻啉农药残留时,平均回收率是83.7%-109%,变异系数是2.0%-5.8%.。当噻虫啉和氯噻啉残留总量在20-250μg/kg之间,多酶标ECL-ELISA能准确分析不同比例(1∶4-4∶1,m/m)的噻虫啉和氯噻啉的残留,实验结果表明建立的ECL-ELISA对氯噻啉和噻虫啉的检测分析是一种非常有潜力的方法。  用建立的ECL-ELISA和HPLC方法同时检测氯噻啉和噻虫啉在番茄真实样品中的降解趋势。ECL-ELISA和HPLC检测结果的有很好的相关性,相关性方程为y=1.023x-0.0494,相关系数为R2=0.996。结果表明建立的ECL-ELISA能简单、快速、准确的检测农产品中残留的噻虫啉和氯噻啉。  合成了烯唑醇半抗原,采用混合酸酐法将烯唑醇半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联制备了包被抗原;与牛血清蛋白(BSA)偶联制备了免疫抗原用于免疫BALB/c小鼠。将骨髓瘤细胞SP2/0与免疫过的小鼠脾脏细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞。通过系列筛选和亚克隆,最后得到一株能稳定分泌抗烯唑醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株(E8/H3)。当包被抗原的浓度为4mg/L时,用间接非竞争酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定烯唑醇抗体的效价达到3.6×106。  通过反应条件优化确定了最佳检测条件。在最优的条件下(20%甲醇PBS溶液、Na+0.2mo1/L、pH6.5-8.5),建立了基于单克隆抗体的烯唑醇间接竞争酶联免疫分析方法。方法的IC50值为0.05mg/L,最低检测限IC10值为5.47μg/L。单克隆抗体具有很高的特异性,除与烯效唑和己唑醇有很小的交叉反应外(CR<1.82%),与其他三唑类杀菌剂没有明显的交叉反应。在蒸馏水、自来水、池塘水、梨和番茄样品中添加0.01-0.5mg/L(mg/kg)的烯唑醇标准品,在水中的平均回收率在80.00%-116.87%,在梨和番茄中的平均回收率在79.20%-111.32%,符合农药残留检测的要求。并对所建立的方法用GC-ECD法进行了评估,两者的测定结果具有很高的相似度,相关系数为R2=0.9863。
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