【摘 要】
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背景支气管哮喘是一种以气道炎症、气道高反应性和气道重塑为特征的慢性气道疾病,气道上皮是气道炎症和气道先天免疫的重要参与者。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一种闭合环状非编码RNA,越来越多研究证实circRNA广泛涉及多种疾病的生理病理过程。但是,环状RNA是如何参与调节气道上皮炎症反应的机制目前尚不清楚。因此,深入研究circRNA调控气道炎症的作用机制可以为哮喘的诊断治
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背景支气管哮喘是一种以气道炎症、气道高反应性和气道重塑为特征的慢性气道疾病,气道上皮是气道炎症和气道先天免疫的重要参与者。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一种闭合环状非编码RNA,越来越多研究证实circRNA广泛涉及多种疾病的生理病理过程。但是,环状RNA是如何参与调节气道上皮炎症反应的机制目前尚不清楚。因此,深入研究circRNA调控气道炎症的作用机制可以为哮喘的诊断治疗提供新的策略,具有重要意义。目的探讨环状RNA（circDHTKD1）在气道炎症模型中的表达情况,并研究circDHTKD1在脂多糖（LPS）诱导的的炎症反应中的作用机制。方法1.构建LPS诱导的BEAS-2B细胞炎症模型1.1以不同浓度LPS刺激BEAS-2B细胞24小时后,CCK8法检测细胞活力的变化。1.2使用5μg/m L LPS刺激BEAS-2B细胞24时后,实时荧光定量PCR及ELISA检测IL-6、IL-8、TNF-α和VEGF的m RNA相对表达量。2.circDHTKD1对LPS诱导旳BEAS-2B细胞炎症反应的影响2.1用5μg/m L LPS刺激BEAS-2B细胞24时后,实时荧光定量PCR检测circDHTKD1相对表达量。2.2通过细胞核质分离和Sanger测序分析circDHTKD1的特性。2.3在BEAS-2B细胞中转染si RNA干扰circDHTKD1表达后予LPS刺激24小时,实时荧光定量PCR法分析IL-6、IL-8、TNF-α和VEGF的m RNA水平的变化;酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测IL-6和VEGF蛋白水平的变化。3.circDHTKD1与miR-338-3p靶向关系的验证3.1双荧光素酶报告基因检测circDHTKD1与miR-338-3p的结合能力。将circDHTKD1全长的野生型质粒（psi CHECK2-circ-WT）和突变型质粒（psi CHECK2-circ-MUT）分别与miR-338-3p mimic、miR-NC转染,双荧光素报告基因检测系统分析荧光素酶活性的变化。3.2在BEAS-2B细胞中转染si RNA干扰circDHTKD1表达,实时荧光定量PCR检测miR-338-3p相对表达量。4.circDHTKD1/miR-338-3p轴调控LPS诱导的炎症反应的分子机制4.1在BEAS-2B细胞中干预miR-338-3p的表达,实时荧光定量PCR和ELISA检测IL-6和VEGF的表达,Western Blot检测ERK通路蛋白磷酸化情况。4.2通过功能挽救实验,明确circDHTKD1/miR-338-3p轴对细胞炎症因子分泌和ERK通路激活的影响。结果1.5μg/m L及以上浓度的LPS能显著抑制BEAS-2B细胞活力,并诱导炎性细胞因子（IL-6、IL-8、TNF-α和VEGF）的合成和分泌。2.circDHTKD1（hsa＿circ＿0017724）在LPS处理后的BEAS-2B细胞中表达上调,其具有环状结构,且主要定位于细胞质。3.在BEAS-2B细胞中干扰circDHTKD1表达,miR-338-3p表达量相应上调,双荧光素酶报告基因证实circDHTKD1能与miR-338-3p靶向结合,并且circDHTKD调控IL-6和VEGF的表达。4.miR-338-3p在LPS处理后的BEAS-2B细胞中表达降低,过表达miR-338-3p抑制ERK通路激活。5.circDHTKD1通过miR-338-3p调控ERK通路并影响LPS诱导的炎症因子（IL-6和VEGF）的合成释放。结论本研究表明,在LPS处理的BEAS-2B细胞中,circDHTKD1通过海绵吸附miR-338-3p调控ERK通路激活和炎症因子分泌。
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