自从1997年世界首例体细胞克隆绵羊多莉诞生以来,体细胞核移植技术在多个物种中得以成功实践。转基因技术与体细胞克隆技术相结合是目前制备转基因大动物的主要手段。但由于克隆技术体系并不完善,至今仍未克服克隆效率低的问题。而转基因技术的介入,使得转基因克隆技术又增加了更多的变数。在转基因动物制备过程中出现了很多问题,如胚胎移植后妊娠率低、流产率高、胎儿发育异常、出生死亡率高等。而外源基因整合效率低,以及外源基因的沉默或丢失等现象更加制约了这项技术的实际应用。在总结了大量的前期工作的基础上,我们对以牛为主的体细胞克隆体系进行了系统的改进与调整。包括卵母细胞的成熟、去核时间段的选择、重构胚激活处理方式、胚胎培养、受体母牛的发情状态与胚胎发育时期的匹配等都进行了改进,形成了一套较为完整的牛体细胞克隆技术体系。利用改进的技术体系开展了大规模的转基因克隆牛生产。共完成对33043枚卵母细胞的去核与注核操作,得到融合胚胎26548枚,生产出各种转基因克隆囊胚7519枚,规模化克隆囊胚效率为28.3%。共移植受体牛1523头,妊娠414头,妊娠率为27.2%。通过将体细胞克隆技术的系统改进与大规模的转基因克隆牛生产实践相结合,发现并尽可能地解决了克隆技术产业化过程中的存在的一些问题,对克隆及转基因克隆技术的产业化应用具有较强的指导意义。1、牛体细胞克隆技术的若干改进与优化本研究对牛体细胞核移植的技术程序进行了以下几个方面的改进和优化：两步法培养卵母细胞、优化了激活时间点、两步激活处理等。结果显示：1)在成熟培养的第16h去除卵丘细胞后,继续培养至20-22h后进行核移植操作,相比传统的20-22h去除卵丘的一步培养法能显著的提高去核率(95.1%vs74.3%,P<0.05)和克隆胚胎的囊胚发育率(46.9%vs36.5%,P<0.05),并显著降低了囊胚细胞的异常核型的比例(P<0.05)。2)对融合后的重构胚胎进行免疫组化分析显示,融合后的1h和2h,分别有96%和80%的胚胎染色体会出现早期染色体凝集。而3h至4h后这一比例会降至50%以下,染色体也会渐渐扩散或成拉长的带状分布。当时间延长至5h-6h时,超过80%的胚胎会出现染色体四散漂移或分成几部分的现象。因此我们将融合和激活的间隔时间控制在2h以内。3)从成熟时间算起第22、24、25、26、27、28小时开始激活重构胚,发现26小时激活可以获得最高的囊胚率。4)使用离子霉素对融合胚的两次激活,显著提高了克隆胚胎的发育率和后期妊娠率(50.5%vs35.6%,P<0.05)。2、克隆胚胎的选择与受体母牛发情状态的匹配本研究试图通过选择适宜发育阶段的转基因克隆胚胎与同期发情的受体合理匹配来提高妊娠率,降低流产率。研究结果显示：1)试验中胚胎的发育速度不尽相同,在发育6、7、8、9天得到的囊胚中,发育六天的囊胚有着最高的孵化率(82.4%vs46.2%vs16.1%vs7.1%,P<0.01),囊胚质量显著提高。胚胎移植后的妊娠率也显著高于其他组。2)为了探讨转基因克隆胚胎与受体最佳的匹配方式,将不同胚龄的胚胎移植到发情6、7、8天的受体中,发现发情6天的受体移植早期囊胚和紧缩桑葚胚的妊娠率最高,发情7天的受体早期囊胚和囊胚的妊娠率最高,而发情8天的受体则更适合移植扩张囊胚和孵化囊胚。3)为了找到最适合的移植胚胎数量,我们将1枚、2枚或3枚胚胎移植到同期发情受体中,45天妊检发现移植1枚胚胎的妊娠率明显偏低(57.9%vs69.8%vs71.4%, P<0.05),而移植2枚和3枚胚胎的受体会出现较高的早期流产率(P<0.05),从而造成其妊娠到期率反而会低于移植1枚胚胎组(45.4%vs29.5%vs25.0%,P<0.05)。4)对于冷冻胚胎的选择结果显示,玻璃化冷冻后相对于其他发育阶段的胚胎,孵化囊胚的复苏率最高可达到100%,而且还有着最高的移植妊娠率。3、多不饱和脂肪酸去饱和酶基因(fat-1)的转基因克隆牛制备从线虫中分离筛选出fat-1基因,人源化处理后构建成无筛选标记的安全转基因表达载体。转染奶牛胎儿成纤维细胞后,筛选出阳性细胞作为核供体,通过体细胞克隆技术生产出fat-1转基因奶牛ZK002。对转基因奶牛进行检测显示,fat-1基因已成功整合到其基因组内。耳皮肤组织的脂肪酸含量分析显示,所有ω-3PUFAs含量明显上升,ω-6PUFAs含量则显著下降。在自然交配产犊后,我们分析了乳汁中的脂肪酸含量,相比对照组ZK002乳汁中的ω-3PUFAs含量明显上升,ω-6/ω-3PUFAs的比率也大幅下降至1左右。