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脂肪酶(lipase, EC 3.1.1.3)是分解三酰甘油的水解酶类,还可以催化酯合成、酯交换等反应,它是一类水解三酰甘油生成游离脂肪酸和甘油的界面酶,具有优良的底物特异性和立体选择性。脂肪酶同时具有反应条件温和、副产物少、环境污染小等优点,因此已广泛应用到了食品加工、油脂化工、有机合成与拆分、生物能源、环境治理、医药、造纸、洗涤等行业中。本文对脂肪酶基因启动子的克隆,脂肪酶基因的分泌表达,脂肪酶基因的展示表达以及脂肪酶的定向进化等方面进行了研究。本文共得到以下结果:1利用接头PCR技术分离到一段白地霉(Geotrichum candidum)脂肪酶基因(lip42)的5’侧翼序列,长度为910bp,分析发现其具有真核基因启动子的典型结构特征。2构建了含有白地霉脂肪酶基因成熟肽序列的重组表达载体pET26-lip42,但在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中并没有表达出具有生物活性的脂肪酶,SDS-PAGE发现部分短肽,分析发现这是因为在大肠杆菌中lip42含有稀有密码子所致,使得翻译提前终止。3对产脂肪酶的酵母筛选培养基进行了改良,重组酵母在改良型培养基上既能产生清晰的透明水解圈,又能正常生长。为研究产脂肪酶的重组酵母,特别是脂肪酶的定向进化提供了一种合适的功能筛选培养基。4构建了酿酒酵母重组表达载体pHBM354-lip42,并且实现了在酿酒酵母(Saccharamyces cerevisae)INVScⅠ中的正确表达。用碱滴定法测定脂肪酶酶液的活性,测得初始发酵的脂肪酶活力为0.3U/mL,脂肪酶的比活力为130.58U/mg。5构建了含有lip42前导肽序列的展示表达载体pAMB121-lip42和含有lip42成熟肽序列的展示表达载体pPIC9K-Flo1-lip42,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行表达,实现了脂肪酶在毕赤酵母细胞表面的展示表达。6建立了一个脂肪酶定向进化的技术平台,主要由体内重组构建突变体库和功能培养基筛选突变体库两步法组成。共筛选到13个脂肪酶活性提高的突变体,测定其中一个突变体(ep3)的比活力为514.98 U/mg,是野生型脂肪酶的近4倍。简言之,本研究使用了大肠杆菌BL21、酿酒酵母INVScⅠ、毕赤酵母GS115三种宿主表达白地霉脂肪酶基因,在酿酒酵母中实现了分泌表达,在毕赤酵母细胞表面实现了展示表达。此外,本研究建立了一个脂肪酶定向进化的技术平台,获得了13个脂肪酶活性提高的突变体,其中一个突变体的比活力提高了近4倍。