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小麦是世界上最重要的粮食作物之一,小麦白粉病由禾本科布氏白粉菌小麦专化型(Blumeriagraminis f.sp.tritici,Bgt)引起,是世界上小麦主产区的主要病害之一,严重影响小麦产量与品质。当前,耕作制度和栽培技术的改变难以解决白粉病的侵染和蔓延,依赖化学防治尽管对控制白粉病的发生和流行取得了一定成效,但不可避免地造成成本增加和环境污染,有悖于绿色发展理念,因此,发掘利用小麦抗白粉病优异基因,利用分子育种技术选育抗病品种是控制白粉病流行,降低经济损失的首要方法。粗山羊草是小麦D基因组的供体,蕴含着丰富的抗逆、抗病基因,其中Pm35被证明是一个抗谱广泛,无农艺性状负面影响的优异基因,已在国际育种应用多年。前期,我们已经精细定位Pm35,并组装了目标基因区间含Gap的物理图谱,预测了3个LRR候选基因。为了进一步明确候选基因所在区间物理图谱信息,本研究拟通过CRISPR-Cas9核酸酶定点酶切,首次利用ExoCET技术直接从作物基因组DNA中克隆出大片段目标DNA,从而,确认候选基因序列。另外,通过酵母双杂交、双分子荧光互补等筛选获得了Pm35的互作蛋白,初步揭示了Pm35从二倍体粗山羊草到六倍体小麦背景抗病变化的分子机制,具体研究结果如下:(1)前期,在抗白粉病基因Pm35精细定位的基础上,我们组装了目标基因区间含Gap的物理图谱,并根据该物理图谱信息,利用CRISPR-Cas9核酸酶在体外切割粗山羊草基因组,利用ExoCET直接克隆技术从粗山羊草基因组DNA中成功捕获39kb的目标片段,之后利用Illumina Hiseq 4000将该质粒进行测序,通过SPAdes进行序列组装,明确了候选基因所在区间的物理图谱。(2)通过分析发现,Pm35在二倍体粗山羊草背景中表现为全生育期抗性,但以其为供体合成的六倍体小麦和转基因小麦都表现为成株期抗性。为了揭示产生这一现象的原因,以Pm35为诱饵蛋白,进行酵母文库筛选,获得一个含有WRKY结构域的转录因子,该基因表现为成株期表达模式,并受病原菌诱导,因此确定该WRKY基因为进一步研究的重点对象。(3)本研究利用BSMV-VIGS技术,以粗山羊草2147为受体,获得WRKY沉默表达的植株。结合之前Pm35的过量表达与沉默表达的植株抗病性鉴定,进一步验证Pm35与WRKY的互作抗病功能。之后对WRKY转录因子进行亚细胞定位,发现其定位在细胞核里。(4)进一步利用酵母双杂交、BiFC、Luciferase充分验证Pm35与WRKY转录因子存在互作,并利用酵母双杂交验证Pm35只与小麦D基因组上的WRKY转录因子互作,而与A、B基因组上的WRKY不产生互作,初步解释了Pm35进入六倍体小麦后抗性减弱的原因。(5)为进一步研究Pm35的调控机理,我们分别构建了含有Pm35 CC结构域与LRR结构域的表达载体,通过酵母双杂交验证与WRKY的互作。最后证明,Pm35的CC结构域与WRKY转录因子存在互作。