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目的:探测活细胞中蛋白质分子间的相互作用,对于揭示这些分子在生理或病理过程中的作用及其机制非常重要。基于荧光蛋白的双分子荧光互补技术是近年发展起来的用于体内或体外表征蛋白质相互作用的一项新技术,作为双分子荧光互补技术的一种改进型,三分段超折叠GFP(sfGFP)系统具有融合片段小,背景荧光低的优势。然而,我们在利用三分段sfGFP系统表征蛋白相互作用时,发现该系统的荧光信号很弱,为了解决这一问题,我们在本研究中通过提高三分段系统中两个片段(G1-9和G11)之间的亲和力,来改善三分段sfGFP系统的荧光信号和信噪比,从而使其更好地用于蛋白相互作用表征。方法:利用HBc单体相互作用为模型,来测试三分段sfGFP系统的有效性;提出2种策略来提高G1-9和G11之间的亲和力来增强三分段sfGFP系统的荧光信号:(1)突变G1-9或者G11,筛选出两者亲和性增强的突变体;(2)将高亲和力分子对连接到G1-9和G11上,以促进两者的亲和力;此外,将G1-9和G11直接共价连接可认为是策略(2)的一种极致,此时,三分段GFP系统变成了一个新的二分段系统。我们首先尝试策略(1),用HBc/HBc相互作用作为筛选模型,对G11进行半饱和突变,通过荧光显微镜观察突变是否提高系统的荧光信号;对于策略(2),先利用FKBP12/FRB相互作用模型,比较三分段sfGFP系统与原二分段sfGFP系统;然后利用FKBP12/FRB相互作用模型,通过流式细胞技术筛选出提高系统信噪比的亲和对,再将筛选出的两种改进型三分段sfGFP系统与原三分段sfGFP系统进行平行比较;通过流式细胞技术,利用两种改进型三分段sfGFP系统分析HBc单体的相互作用。结果:利用三分段sfGFP来测试HBc的相互作用时,发现荧光信号弱,且在显微镜下不易分辨;利用HBc/HBc互作模型,我们将227个G11突变体转染HEK293细胞,在荧光显微镜下观察转染结果,没有发现荧光较原系统有显著增强的突变体;在分析FKBP12/FRB相互作用时,原三分段sfGFP系统在背景和信噪比上均优于二分段sfGFP系统,而荧光信号有所降低;利用FKBP12/FRB互作模型筛选亲和对,流式细胞术结果表明,引入了LgBiT-HiBiT亲和对的新系统以及新二分段系统的荧光强度与S/N都有提高,这两个新系统的最高的S/N分别达到了56和111,且LgBiT-HiBiT改进型三分段系统以及新二分段系统的最优组的S/N,与原有的三分段系统的最优组相比,分别增加了1倍和6倍,激光共聚焦显微分析结果与FACS结果一致;对于表征HBc单体的相互作用,流式细胞分析结果显示,仅LgBiT-HiBiT改进型三分段sfGFP系统的S/N较原来增加了2倍,而新二分段sfGFP系统的荧光细胞比例有所增加,但并未提高S/N,激光共聚焦显微分析结果与FACS结果一致。结论:在原有三分段sfGFP系统的基础上,利用HBc/HBc和FKBP12/FRB这两个相互作用模型,通过引入一对亲和分子LgBiT-HiBiT显著改善了原有系统的荧光信号并且显著提高该系统的信噪比;新的二分段系统在分析FKBP12/FRB相互作用时能显著改善信噪比。同时,这种新型二分段sfGFP系统衍生出来的一种新的BiFC分段策略可能推广到其他结构类似的荧光蛋白,用于开发新的BiFC。