幽门螺杆菌Tipα通过Wnt/β-catenin信号通路上调胃癌干细胞Nanog和Oct4表达

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目的:肿瘤坏死因子α诱导蛋白(Tipα)是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)新的致癌蛋白,在胃癌的发生和发展中起到重要作用。本研究富集、分离人胃癌SGC-7901细胞源性的胃癌干细胞(GCSC),观察Tipα蛋白对GCSC标志物、相关干性基因表达的影响以及Wnt/β-catenin通路在其中的作用,为进一步阐明H.pylori的致癌机制奠定基础。方法:大量诱导表达Tipα蛋白,并用SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定。利用无血清超低吸附培养人胃癌细胞SGC-7901富集得到球状胃癌干细胞(GCSC),q RT-PCR和Western-blot检测球体GCSC标志物CD44及相关基因Oct4和Nanog表达情况;显微镜观察SGC7901和球体细胞的球体形成。使用不同浓度Tipα分别刺激球体GCSC不同时间,通过q RT-PCR和Western-blot方法检测CD44表达情况;利用Western-blot检测β-catenin Ser675和Ser 552的磷酸化情况;细胞免疫荧光实验观察β-catenin的核聚集和核转位。用不同浓度Tipα刺激GCSC不同时间,q RT-PCR和Western-blot分别检测Wnt/β-catenin通路下游靶基因Oct4和Nanog m RNA和蛋白的表达情况;使用Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939预处理球体GCSC,观察通路阻断后对Tipα诱导的标志物CD44和下游靶基因Oct4和Nanog表达的影响。结果:1、无血清超低吸附培养人胃癌细胞SGC-7901富集得到的球状GCSC,其GCSC标志物CD44及干细胞相关基因Oct4和Nanog表达量均显著高于原代SGC7901细胞。2、Tipα刺激可以使GCSC标志物CD44表达量增加,并且随着Tipα浓度增加和刺激时间的延长而增加。3、Tipα可以使β-catenin Ser675和Ser552发生磷酸化。4、细胞免疫荧光结果显示,Tipα可以使GCSC中的β-catenin在细胞质中聚集并转位至细胞核。5、Tipα可以使Wnt/β-catenin通路下游靶基因Oct4和Nanog的m RNA表达量增加,最佳刺激浓度和时间分别为150μg/m L和12h。6、Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939预处理球状GCSC后,Tipα诱导的GCSC标志物CD44表达减少;β-catenin Ser675和Ser552的磷酸化及通路下游靶基因Oct4和Nanog表达均受到抑制。结论:幽门螺杆菌Tipα可通过激活Wnt/β-catenin信号通路上调胃癌干细胞基因Oct4和Nanog的表达。
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