一、目的 观察体外培养的豚鼠耳蜗微血管内皮细胞在不同剪切力作用后的形态学改变及其可能的改变机理，进一步丰富血迷路屏障通透性调控机理。 二、方法 1．通过体外培养的方法，获取单层融合的豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞，豚鼠脑微血管内皮细胞以及人脐V内皮ECV-304的单层融合状态。2．设计一套由驱动恒流泵、蠕动泵、储液器及若干导管组成的流体力学灌流系统，通过控制流量产生不同力量对上述培养好的细胞施加剪切作用。3．对于豚鼠耳蜗微血管内皮细胞我们设计τ=0.883dyn／cm~2、0.976dyn／cm~2、1.184 dyn／cm~2、2.929 dyn／cm~2，四个剪切力，在0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h 8个时相点用倒置相差显微镜对受到剪切力作用后的细胞进行形态学观察，在对应时相点对细胞形态进行照相，用Tiger图像分析仪进行形状参数Pyx和Q的测定。同样，对脑微血管内皮细胞设计剪切力大小为0.276 dyn／cm~2、0.476dyn／cm~2、1.069 dyn／cm~2，对ECV-304细胞设计剪切力大小为5 dyn／cm~2，观察时相点及内容同耳蜗微血管内皮细胞，把各个观测点的数据绘制成表，并进行统计学分析得出相应的结果，以研究各个剪切力对不同细胞的形态学影响及其与时间的关系，并绘制成曲线图。4．剪切过后的耳蜗微血管内皮细胞用phalloidin进行固定染色，对F-actin进行激光共聚焦荧光染色观察，绘制成不同剪切力下F-actin荧光含量表，并绘制成变化曲线，进行统计学分析了解其与时间的关系。 三、结果 1．豚鼠耳蜗血管纹组织段在0.5％Ⅰ型胶原酶消化后约3小时即可见细胞游离，部分成团，培养24h后可见贴壁生长的“细胞岛”，4天后可见“细胞岛”逐渐扩大，出现融合趋势，单个细胞外观呈椭圆、三角或卵石形，剔除可疑杂细胞，细胞排列成致密融合单层后，呈现典型“铺路石”样外观。豚鼠脑微血管段经胶原酶消化后2h即贴壁，3天后形成致密的单层“铺路石”样外观。EVC-304经培养后3天即可生长为单层融合状态。上述细胞经免疫组化鉴定，95％以上对Ⅷ因子抗原反应阳性，证实为内皮细胞。 2．对于豚鼠耳蜗微血管内皮细胞，τ=0.883 dyn／cm~2、τ=0.976 dyn／cm~2时作用24h并未发生细胞形态及排列的改变，当τ=1.184 dyn／cm~2时，作用8h后细胞形态开始出现第三军医大学硕士学位论文顺应性变化，单个细胞由以前的椭圆变得长梭，整体细胞排列由以前无序变得顺流体方向有序性，随时间延长，变化趋势更明显。对于脑微血管内皮细胞当下二0.276 dy可c扩时，作用24h未发生形态学变化，当下=0.476dy吹mZ时，剪切作用4h后单个细胞逐渐由短圆形变为长梭形，细胞整体排列逐渐有序，下=l .069d州cmZ作用16h后则发生细胞间隙增大、脱落。对于人脐v内皮细胞，T巧dy可cmZ作用24h仍未见形态学改变。3.对豚鼠耳蜗微血管内皮细胞F一actin的荧光染色观察当T=0.976勿可c扩时，作用8h后虽然细胞未见形态学变化，但F一actin含量增加，微丝排列有序，出现应力纤维，随着剪切力加大，时间延长，这种趋势更明显。 四、结论 豚鼠耳蜗微血管内皮细胞在受到剪切作用后其形态学不同于静态培养的内皮细胞。在流体力学环境中，形态学变化可以影响其通透性。受到剪切作用后的细胞之所以会产生形态学改变，可能与细胞骨架机制有关。实验数据表明，豚鼠耳蜗微血管内皮细胞所能耐受剪切力大小明显小于脐V内皮细胞，但又大于脑微血管内皮细胞，且耐受剪切力范围较小，说明内耳微环境相对较稳定，但对剪切力变化非常敏感，这一现象很可能是高切应力疾病发病的原因。这为进一步开展生理、病理条件下耳蜗血迷路屏障的调控提供指导。