目的原发性肝细胞癌(HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,发病率及病死率呈逐年上升趋势,严重威胁到我国人民的身体健康,增加我国经济建设的负担。2008年,据贵州省疾病预防控制中心不完全统计,HCC在贵州地区是仅次于肺癌的第二大恶性肿瘤,但既往尚缺较完善的贵州地区HCC危险因素调查。贵州是多民族聚居地区,具有较为独特的地理文化背景,本课题拟通过回顾性人群病例对照研究,调查贵州地区HCC的危险因素,并探讨饮用贵州茅台酒(以下简称茅台酒)与HCC发生的相关性,以比值比(OR)表示相对危险度,探索饮用茅台酒与HCC的发生是否具有统计学联系。通过动物实验,探讨茅台酒对复合因素所致HCC大鼠肝组织P53基因突变的影响,并探讨茅台酒对大鼠酒精代谢相关肝药酶中乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)、细胞色素P450 2E1 (CYP2E1)的影响。方法2010年12月到2011年12月在贵阳医学院附属医院、遵义医学院附属医院、贵州省肿瘤医院、茅台酒厂职工医院及各地州市医院等9家单位就诊的HCC患者及相应住地人群开展相关流行病学调查。HCC入选病例的诊断参照中国抗癌协会关于HCC的最新诊断标准。排除标准：转移性肝癌、炎性假瘤、自身免疫性肝病、遗传性肝病等影响因素。饮酒暴露因素标准：饮酒定义为每周饮酒两次以上,时间超过1年。饮用茅台酒组人群划分为完全饮用或非完全饮用。问卷调查、体格检查和实验室检查均由专业医护人员按统一的规范进行。记录并且整理相关调查数据后,采用SPSS 16.0软件进行统计学分析,经卡方检验、分层分析、单因素非条件Logistic回归分析,将单因素分析有意义的自变量带入多因素Logistic回归模型,调整混杂因素,计算饮用茅台酒的OR值,探讨饮用茅台酒与HCC发生的相关性。动物实验部分,参照文献采用饮酒加黄曲霉素B1 (AFB1)及0.015%二乙酰氨基芴(AAF)复合因素复制大鼠HCC模型,通过肝组织病理学检查以及特异性肝癌标志物磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)免疫组织化学检测判断HCC动物模型是否复制成功,采用Masson三色法观察各组大鼠肝组织内胶原纤维沉积程度,化学发光法检测血清透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(CollV)含量,并提取大鼠肝组织DNA,设计P53引物,对P53基因变异进行直接测序。采用高、中、低剂量茅台酒或乙醇复制大鼠急性酒精性肝病模型,生化方法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转氨酶(AST),顶空-气相色谱法测定血液中乙醇、乙醛含量；酶联免疫法检测肝组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px).丙二醛(MDA)、乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)含量,HE染色观察肝脏的病理组织学改变,RT-PCR检测肝组织中ADH1、 ALDH2 mRNA的表达,免疫组织化学法及Western Blotting检测肝组织中ADH1、 ALDH2蛋白的表达。采用茅台酒或相同剂量乙醇(10mL·kg-1)复制大鼠慢性酒精性肝病模型,生化方法检测血清ALT、AST,酶联免疫法检测肝组织匀浆中SOD、GSH-Px、MDA含量,HE染色观察肝脏的病理组织学改变,RT-PCR检测肝组织中CYP 2E1 mRNA的表达,免疫组织化学法及Western Blotting检测肝组织中CYP 2E1蛋白的表达。结果病例组吸烟者210例(27.6%)、非酒精性脂肪肝336例(44.1%)、酒精性肝病245(32.2%)、HCC家族史141例(16.5%)、饮酒者300例(39.4%)、乙型肝炎病毒(HBV)感染者436(57.2%)、经常进食腌制、霉变食物290例(38.1%)、5年前经济状况好152例(19.9%)；对照组,吸烟者116例(14.5%)、非酒精性脂肪肝160例(20.1%)、酒精性肝病101例(12.7%)、HCC家族史40例(5.0%)、饮酒者180例(22.6%)、HBV感染82例(10.3%)、经常进食腌制、霉变食物225例(28.2%)、5年前经济状况好352例(44.1%)。其OR值分别为3.520、2.464、4.330、2.219、2.451、19.245、6.212、0.174,P值均<0.01,差异有统计学意义。分层分析发现：酒精摄入量≤25g/d和>25g/d的调整OR值分别为0.474、4.909；饮酒年限≤20年和>20年的调整OR值分别为1.865、4.345,其中饮酒合并HBV感染者的调整OR值达96.903；完全饮用茅台酒和非完全饮用茅台酒的调整OR值分别为0.340、1.812,在适量饮酒人群中(酒精摄入量≤25g/d),完全饮用茅台酒和非完全饮用茅台酒的调整OR值分别为0.331、0.775,在过量饮酒人群中(酒精摄入量>25g/d),完全饮用茅台酒和非完全饮用茅台酒的调整OR值分别为1.269、5.932。成功复制AFB1加饮酒诱导大鼠肝癌模型。造模过程中,因多种原因茅台酒组死亡14只,白酒组死亡18只大鼠,正常对照组无死亡。单纯灌胃8w末,普通白酒高剂量组随机处死的2只大鼠肝脏均发现有纤维增生,肝细胞点灶状坏死,汇管区见短窄纤维增生。其余四组未见纤维增生。16w末,普通白酒低剂量组1只、普通白酒高剂量组2只大鼠肝脏纤维增生。茅台酒组表现为肝细胞脂肪变性,肝细胞点灶状坏死。24w末,茅台酒低剂量组1只、茅台酒高剂量组、普通白酒低、高剂量组各2只大鼠观测到肝脏纤维增生。经过8w的肝癌模型短期复制,茅台酒低剂量组1只、茅台酒高剂量组6只、普通白酒低剂量组7只、普通白酒高剂量组6只观测到肝硬化。茅台酒高剂量组1只、普通白酒高剂量组5只观测到肝硬化并肝癌。茅台酒组肝纤维化、肝硬化并肝癌的发生率均显著低于白酒组(P<0.05),正常对照组未发现肝脏纤维增生。P53基因的突变检测：成功扩增54例P53基因5、6、7、8号外显子,测序显示突变方式以碱基插入为主,其次为碱基突变及缺失。茅台酒组突变率为42.3%,白酒组突变率为78.3%,差异具有统计学意义(P<0.05)。急性酒精性肝病模型部分：与乙醇组比,末次灌胃12h后茅台酒中、低剂量组大鼠血中乙醇、乙醛含量明显降低(P<0.01)；在大鼠肝匀浆中,茅台酒高、中、低剂量组SOD、GSH-Px均明显增高(P<0.01),茅台酒中、低剂量组MDA明显降低(P<0.01),茅台酒低剂量组ADH明显增高(P<0.01),茅台酒高、中、低剂量组ALDH均明显增高(P<0.01)；肝组织中,茅台酒低剂量组ADH1 mRNA及蛋白质表达明显增高(P<0.01),茅台酒高、中、低剂量组ALDH2 mRNA及蛋白质表达均明显增高(P<0.01)。上述检测指标在茅台酒高、中、低剂量组之间相互比较,均具有统计学差异(P<0.01)。慢性酒精性肝病模型部分：茅台酒组及乙醇组大鼠肝组织切片HE染色均可见不同程度肝细胞脂肪变性及炎性细胞浸润,但茅台酒组显著较少(P<0.05)；与空白对照组及乙醇组比,末次灌胃12h后茅台酒组大鼠肝组织匀浆中SOD、 GSH-Px均显著较高(P<0.01),与乙醇组比,未次灌胃12h后茅台酒组大鼠肝组织匀浆中MDA显著较低(P<0.01)；与空白对照组比,茅台酒组大鼠肝组织中CYP2E1 mRNA及蛋白质表达较高,差异无统计学意义(P>0.05),与乙醇组比,茅台酒组大鼠肝组织中CYP2E1 mRNA及蛋白质表达显著较低(P<0.01)。结论研究结果表明(1)HBV感染、经常食用腌制或霉变食物为贵州人群HCC常见的危险因素,吸烟及过度饮酒也可增加患HCC的风险,同时饮酒还可增加HBV感染者患HCC的风险；完全饮用茅台酒的人群较其他饮酒人群发生HCC的危险度相对较低。(2)长期饮用茅台酒导致大鼠P53基因突变相对较少,可能是该组大鼠较少发生HCC的原因之一。(3)饮用茅台酒(5ml·kg-1)1周对大鼠ADH的影响与同等剂量乙醇无显著差异,但对大鼠ALDH的消耗显著低于乙醇组,从而减少乙醛在体内的蓄积,减轻乙醛对机体的毒害作用,但随着饮酒量增大,其对肝脏造成的不良影响也会增高。饮用茅台酒(10ml·kg-1)12周后可致大鼠酒精性脂肪肝,但比饮用同等剂量乙醇程度较轻,可能与茅台酒所含除乙醇外的其他成分抑制CYP2E1表达,对抗氧化应激有关。