研究背景:　　骨髓微环境通过各种机制调控骨髓造血功能,骨髓微环境的改变必然会导致造血功能的改变。随着人们对骨髓微环境在白血病发病机制及治疗中的研究,骨髓微环境中重要成份间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)因其多种潜能,在白血病病情变化及治疗中备受瞩目。MSCs拥有多向分化的潜能,在不同的诱导条件下可分化为脂肪、肌肉、软骨和神经细胞等多种组织。MSCs还在机体正常造血过程中起重要作用,可通过直接粘附、分泌细胞因子及粘附分子等影响造血干细胞的增殖、分化、生存和黏附归巢等。近十年来,研究发现MSCs参与了白血病的发生、发展过程,并与白血病细胞的耐药、抗凋亡等特性有关。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)是一种多功能细胞因子,参与细胞增殖与移动、造血、血管生成、抗凋亡、修复组织损伤和调节细胞免疫等。HGF除了参与调节正常细胞生成、分化、迁移外,也参与细胞的恶性转化。骨髓中HGF是由骨髓基质细胞产生,在病理情况下,骨髓基质细胞异常分泌HGF,而白血病细胞广泛表达HGF的特异性受体c-Met,HGF与c-Met结合后调控着白血病细胞的增埴、分化、粘附及生存等,可作为白血病的治疗靶点和预后的指标。HGF与白血病的发生、发展和预后关系密切,已成为目前白血病研究的热点之一。　　研究目的和意义:　　以往的研究主要分别从HGF与白血病细胞的关系和/或HGF与MSCs的关系研究HGF在白血病中的意义,而在阻断HGF/c-Met信号通路的情况下,MSCs对白血病细胞生存、增殖及凋亡的作用能否受到影响,同时在与MSCs共培养体系中,白血病细胞对化疗药物的敏感性是否发生改变,如何变化等问题,目前国内外尚缺乏相关研究。另外,主要研究对象是成人白血病,针对儿童白血病的甚少。为此,(1)本课题研究HGF是否在儿童白血病中也有类似成人的表达及意义,并从临床角度分析HGF的表达水平与白血病治疗效果的关系,对白血病的治疗效果的预测有一定的临床指导意义;(2)在MSCs-白血病细胞共培养体系中,通过抗HGF抗体干预MSCs分泌的HGF后,观察白血病细胞的粘附、增殖及化疗敏感性是否受到影响,揭示MSCs的耐药新机制及研究HGF在儿童白血病中能否作为新的治疗靶点。　　研究方法:　　1.收集28例白血病患儿和20例对照儿童的外周血清。收集25例白血病患儿的骨髓2～5ml,分离、扩增、鉴定,以获得足量的MSCs及收集MSCs培养上清。选用慢性髓细胞白血病急性红白血病变细胞珠K562及其耐药珠K562/AO2(耐阿霉素细胞株)、K562/G01(耐伊马替尼细胞株)。　　2.采用酶联免疫吸附实验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)检测白血病患儿和对照儿童的外周血清及白血病患儿MSCs培养上清中的HGF。　　3.共培养分组:实验组为各种白血病细胞与白血病患儿MSCs粘附共培养加HGF抗体组,对照组为各种白血病细胞与白血病患儿MSCs粘附共培养组,对照组只加入等量培养液。　　4.通过荧光倒置显微镜观察粘附共培养各组中白血病细胞在MSCs层上的粘附况并计算粘附率。　　5.应用MTT法检测共培养各组中白血病细胞的增殖情况。　　6.使用流式细胞仪测定共培养各组中白血病细胞的周期。　　7.在K562、K562/G01共培养各组中加入不同工作浓度的伊马替尼孵育48小时后,通过流式细胞仪检测白血病细胞的凋亡率来观察HGF对白血病细胞药物敏感性的影响。　　8.临床资料的收集、病例随访:收集白血病患儿的化疗资料,随访白血病患儿在化疗后的缓解情况。　　9.数据分析采用SPSS13.0统计软件,所有数据予Shapiro-WilkW检验检测是否符合正态分布。正态分布资料数据用均值±标准差(X±S)表示,两个样本间均数比较采用两独立样本t检验,多个样本采用方差分析且均数间的两两比较采用LSD法;偏态分布资料数据用中位数(范围)表示,并用箱式图表示最低值、中间值、最高值,采用Mann-Whitney秩和检验;检验水准为α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。　　结果:　　1.MSCs鉴定:荧光倒置显微镜下观察细胞呈长梭状并贴壁生长,流式细胞仪分析MSCs的表面抗原示MSCs阳性表达CD29、CD105、CD90,而CD34、HLA-DR、CD45、CD14、CD11b、CD19则呈阴性。　　2.外周血清中HGF的浓度:白血病初诊及复发患者血清中HGF浓度为1172.03(464.24-5134.40)pg/ml,对照组血清中HGF浓度为301.77(78.25-607.44)pg/ml,差异有统计学意义(P<0.05);白血病完全缓解患者血清中HGF浓度为324.38(98.25-785.76)pg/ml,白血病初诊及复发患者血清中HGF浓度高于白血病完全缓解患者,P<0.05;白血病完全缓解患者与对照组血清中的HGF浓度相比差异无统计学意义(P>0.05)。　　3.HGF血清浓度与急性白血病化疗疗效的关系:急性白血病患儿经诱导缓解治疗后,其中有3例疗效差,疗效差的患者其治疗前HGF血清浓度高于疗效好的患者治疗前HGF血清浓度(P0.05)。　　8.HGF对白血病细胞药物敏感性的影响:各组共培养细胞孵育过夜,加入工作浓度的伊马替尼继续孵育48h后,流式细胞仪测定细胞凋亡结果显示,在K652细胞共培养体系中,实验组中存活细胞比例低于对照组中存活细胞比例,P