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芳香化酶作为雌激素合成的限制酶,在非哺乳类脊椎动物的早期雌性性别分化中起重要的调控作用,Cyp19a1基因作为芳香化酶的编码基因,参与了龟鳖类的雌性性别分化过程。Foxl2基因是叉头框转录因子家族成员之一,在雌性早期性腺分化和卵巢功能维持中扮演重要角色。现有研究结果表明,Foxl2基因位于Cyp19a1的上游,调控芳香化酶基因的表达,二者共同作用参与雌性的性腺分化过程。本研究分析了芳香化酶编码基因Cyp19a1在中华鳖成体不同组织及胚胎发育不同时期雌雄性腺中的表达情况;利用芳香化酶抑制剂和慢病毒介导的RNA干扰/过表达技术,着重进行Cyp19a1和Foxl2基因的功能验证研究。具体研究结果如下:(1)Cyp19a1的功能研究半定量PCR和实时荧光定量PCR结果显示Cyp19a1基因在中华鳖成体卵巢组织中高度特异性表达,睾丸和心、肝、脾、肺、肾、肌、肠中表达微弱或不表达。同时我们发现,Cyp19a1基因在第18期就呈现雌性性腺特异性表达,早于性腺分化启动时间(第19期)。功能缺失实验表明,经过AI及Cyp19a1-shRNA处理后,ZW胚胎性腺皮质区退化,髓质区高度发育,形成原始性索结构,呈现雌性向雄性性逆转现象;同时雌性标记基因Foxl2的表达量下调,雄性标记基因Amh的表达量则显著上调。功能获得实验则表明,Cyp19a1过表达后的ZZ型性腺皮质区高度发育,髓质区退化,形成空洞结构,呈典型雌性特征,同时Foxl2基因的表达量上升,而Amh的表达量显著降低。免疫组化结果显示,雄性标记蛋白Sox9在对照组ZZ雄性性腺的髓质区大量表达;在对照组ZW雌性性腺中未见表达。而在Cyp19a1敲低后的ZW性腺中,Sox9蛋白在髓质区大量表达;相反,Cyp19a1过表达后的ZZ性腺中则未见Sox9蛋白表达。(2)Foxl2的功能研究我们还通过慢病毒载体介导的过表达系统,进行了中华鳖Foxl2基因的功能验证分析。结果表明,Foxl2的过表达导致了ZZ雄性性腺向雌性性腺逆转,皮质区高度发育,但未见明显的卵泡或生殖细胞,髓质区退化形成空洞结构,性腺呈典型雌性性腺特征。荧光定量PCR结果表明,经过表达处理后的ZZ性腺,雄性标记基因Dmrt1和Sox9的表达急剧下调,雌性特异性基因Cyp19a1的表达显著上调。免疫组化结果显示,Foxl2过表达后的ZZ性腺中,Sox9蛋白信号显著降低,甚至未见表达。本文揭示了Cyp19a1基因在性腺分化过程中的表达规律,发现了Cyp19a1的敲低和过表达以及Foxl2的过表达能导致性逆转的发生,明确了Cyp19a1和Foxl2在中华鳖雌性性腺分化过程中是必需的,是早期卵巢分化的关键调控因子。本研究开辟了龟鳖类动物基因功能研究的新途径,为中华鳖性别决定和性腺分化的机理研究奠定基础;同时为中华鳖全雄苗种培育提供了一个新策略,即通过过表达Cyp19a1或Foxl2获得ZZ型雌性个体,ZZ假雌与ZZ雄性个体进行交配产生全雄子代。