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目的通过观察过表达Sirt3促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤愈合的作用,探讨Sirt3介导的FOXO3a/PINK1-Parkin信号通路通过调控线粒体自噬水平影响糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复的机制。方法1.体外实验体外培养小鼠角膜上皮干/祖细胞系(TKE2细胞),实验分组:正常组、甘露醇组、高糖组、高糖+AD-GFP组和高糖+AD-Sirt3组。利用RT-PCR和Western-blot方法分别检测各组中Sirt3、LC3B(线粒体自噬代表性蛋白)、FOXO3a和Parkin分子在m RNA和蛋白质水平的表达差异;应用细胞划痕实验检测过表达Sirt3后高糖环境下TKE2细胞迁移能力变化;应用免疫荧光共定位方法检测线粒体自噬流在各组中的差异。2.体内实验建立链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病C57/BL6小鼠。实验分组:正常小鼠组、糖尿病小鼠组、糖尿病+结膜下注射生理盐水组、糖尿病+结膜下注射AD-GFP组和糖尿病+结膜下注射AD-Sirt3组。RT-PCR和Western-blot方法对比正常小鼠与糖尿病小鼠角膜上皮中Sirt3、LC3B的表达差异;建立小鼠角膜上皮损伤模型,结膜下注射过表达Sirt3腺病毒,检测过表达Sirt3后糖尿病小鼠角膜上皮损伤愈合速率变化及对FOXO3a/PINK1-Parkin信号通路分子FOXO3a、Parkin的影响;免疫组化以及免疫荧光实验分别检测Sirt3、LC3B在小鼠角膜中的定位和表达。结果1.体外实验结果(1)相较正常组,高糖组TKE2细胞中内源性Sirt3的表达下降(P<0.05),信号通路中的FOXO3a、Parkin的表达同样下降(P<0.05);(2)高糖组TKE2细胞线粒体自噬代表性蛋白LC3B表达较正常组明显下降(P<0.05);(3)线粒体、溶酶体和LC3B免疫荧光共定位实验显示:与正常组相比,高糖组TKE2细胞中表明自噬流的三者共定位强度降低。(4)细胞划痕实验显示:高糖组TKE2细胞划痕后迁移面积明显低于正常组(P<0.05);(5)过表达Sirt3明显上调高糖组TKE2细胞中线粒体自噬水平及信号通路FOXO3a/PINK1-Parkin的活性:与高糖组相比,高糖+AD-Sirt3组LC3B表达量与信号通路分子FOXO3a、Parkin的表达量明显增强(P<0.05)。2.体内实验结果(1)与正常小鼠相比,糖尿病小鼠角膜上皮中内源性Sirt3的表达明显下降(P<0.05),线粒体自噬代表性蛋白LC3B表达及信号通路的水平均下降(P<0.05);(2)糖尿病小鼠角膜上皮损伤模型实验显示:刮除角膜上皮后,糖尿病组小鼠角膜上皮的愈合速率明显低于正常组小鼠(P<0.05),过表达Sirt3后,糖尿病+AD-Sirt3组的角膜上皮愈合速率比糖尿病组小鼠明显增快(P<0.05);(3)上调Sirt3后,糖尿病小鼠角膜再生上皮中信号通路FOXO3a/PINK1-Parkin的活性增强,糖尿病+AD-Sirt3组的FOXO3a、Parkin表达明显高于糖尿病组(P<0.05);(4)上调Sirt3后,线粒体自噬水平增强,与糖尿病小鼠相比,糖尿病+AD-Sirt3组小鼠的角膜再生上皮中LC3B的表达明显增强(P<0.05)。结论1.过表达Sirt3促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤的愈合。2.Sirt3激活FOXO3a/PINK1-Parkin信号通路上调线粒体自噬水平。3.上调线粒体自噬水平促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤的愈合。