一、研究背景冠心病心肌缺血和心肌梗死是临床的常见病和多发病,目前研究对于内源性因子在心肌缺血中的功能作用及机制尚缺乏认识。microRNAs (miRNAs)是新发现的一类具有转录后调节活性的重要内源性因子,能够按照碱基互补配对原则与靶mRNA的3’端非编码区序列相互识别,引起靶mRNA的降解和/或翻译抑制。生物信息学分析显示,一个miRNA分子的潜在靶mRNA可能有上百个,提示了miRNA生物学功能的多样性与复杂性。在心肌缺血状态下,miRNAs的变化很可能影响多种靶蛋白的表达,继而影响缺血心肌的结构和功能。目前有关miRNAs与心肌缺血的认识尚局限在极个别miRNAs,而绝大多数miRNAs的表达变化、功能意义以及作用机制仍属未知。本课题通过结扎冠状动脉左前降支建立整体大鼠急性心肌缺血模型,通过miRNA微阵列技术和real-time PCR技术检测了大鼠急性缺血心肌中miRNAs的表达变化,筛选出了差异表达显著的miRNAs;并且,在培养的大鼠H9c2心肌细胞株,构建低氧损伤模型(1%O2-94%N2-5%CO2),确认差异表达的miRNAs在该心肌细胞模型的表达变化。应用人工合成的特异性mimics或inhibitor转染H9c2细胞,使得相应的miRNA过表达或者低表达,并观察对H9c2细胞损伤和凋亡的影响,从而筛选出能有效减轻缺血性心肌损伤的miRNAs;最后,通过对该miRNAs潜在靶蛋白的预测和干预来探讨其作用机制。本工作有助于认识miRNAs在心肌缺血中的作用及机制,并为防治和减轻心肌缺血性损伤提供新的研究资料和实验依据。二、模型与方法1.大鼠急性心肌缺血模型通过结扎大鼠冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery, LAD)建立急性心肌缺血模型。取成年雄性SD大鼠(220-280g)20只,随机分为假手术组和手术组,每组各10只。经20%尿酯(5ml/kg)麻醉后,将大鼠仰卧位固定在手术台上,行气管插管术和机械通气,开胸暴露心脏,以丝线环绕冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery, LAD),稳定15min。手术组大鼠结扎LAD,4 h后取缺血区心肌。假手术对照组大鼠的所有手术过程相同,但不结扎LAD,4h后取“假”缺血区心肌。采用miRNAs芯片杂交或real-time PCR法测定所取心肌组织中miRNAs的表达水平。2.培养的心肌细胞低氧损伤模型将常规培养的大鼠H9c2心肌细胞系进行无血清处理12h以使细胞同步化,然后继续置于无血清培液中,在1%O2-94%N2-5%CO2低氧气体环境中培养24h制备低氧损伤模型,以无血清常氧培养作为对照。24h后收集细胞及细胞上清。测定细胞上清液乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH)活性及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量以评价细胞损伤程度,MTT法测定细胞活力,Annexin V-FITC/PI双标记后行流式细胞术测定细胞凋亡。此外,收获细胞抽提总RNA,通过real-time PCR法检测miRNAs的表达变化。3. MicroRNA芯片杂交分析取急性心肌缺血大鼠和对照大鼠心肌组织样本,抽提总RNA后通过测定OD260/OD280比值和甲醛变性琼脂糖凝胶电泳法检测RNA质量,然后进行miRNAs的分离、荧光标记和芯片杂交实验,芯片杂交实验和数据分析由美国LC Sciences公司完成。最后筛选出大鼠急性心肌缺血模型中异常表达的miRNAs。4. MicroRNAs表达检测通过实时荧光定量PCR法检测心肌组织和培养的H9c2心肌细胞中miRNAs的含量：常规方法抽提RNA,通过茎环结构的特异性引物反转录相应的靶miRNA,然后进行实时荧光定量PCR检测,以GAPDH作为内参照基因,通过标准曲线法定量,分析各样本的miRNA含量,并通过溶解曲线和琼脂糖凝胶电泳确定基因扩增的特异性。5.MicroRNA过表达和低表达干预实验将人工合成的miRNA模拟物(mimic)或阻遏物(inhibitor)在脂质体(siport neofx transfection agent)辅助下转染H9c2细胞,使得相应的靶miRNA高表达或者低表达,观察对H9c2细胞低氧损伤和凋亡的影响。实验分组如下：(1)常氧培养组；(2)低氧培养组；(3)转染miRNA mimics常氧培养组；(4)转染miRNA inhibitor常氧培养组；(5)转染miRNA mimics低氧培养组；(6)转染miRNA inhibitor低氧培养组。6.生物信息学方法预测MicroRNA的靶基因利用TargetScan、Bibiserve、Pictar等microRNAs靶基因预测网站和软件,对大鼠的miRNA的二级结构和靶基因进行预测分析,寻找序列匹配程度高、二级结构稳定、靶序列在物种间高度保守的基因进行后续验证。将人工合成的miRNA mimic或inhibitor在脂质体辅助下转染H9c2细胞,使得相应的靶miRNA高表达或者低表达,通过Western blot分析靶蛋白表达量,以确定miRNA在细胞中能否调控靶基因表达。三、主要结果1.心肌(细胞)缺血模型的建立(1)整体大鼠急性心肌缺血模型的建立结扎大鼠冠脉左前降支后立即出现心电图ST段明显抬高、血压明显下降、左心室前壁缺血区呈青紫色；结扎4h后经伊文氏蓝(Evans blue)和TTC染色后出现蓝色+红色区、红色区和无着色区,分别代表非缺血区、缺血但未梗死区和缺血梗死区。上述结果表明模型建立成功。(2)培养心肌细胞低氧模型的建立与常氧培养的H9c2心肌细胞相比,1%O2缺氧培养24h的细胞表面积减小、细胞间隙变大、培养液中悬浮的死细胞增多；上清液中LDH活性升高1.7倍,细胞活力下降40%,表明细胞低氧损伤模型建立成功。2.心肌缺血状态下microRNAs的表达变化(1)整体大鼠急性缺血心肌microRNAs的表达变化MicroRNA芯片结果表明：与假手术大鼠的正常心肌组织相比,急性缺血心肌中多种miRNAs的表达发生变化,其中miR-21、miR-23a的表达明显上调,而miR-143、miR-199a-3p、miR-378的表达明显下调,其中miR-378下调49%。Real-time PCR的验证结果与芯片实验结果一致,miR-21、miR-23a的表达明显上调,而miR-143、miR-199a-3p、miR-378的表达明显下调,其中miR-378下调42%。(2)低氧培养的心肌细胞中MicroRNAs的表达变化用无血清培液、1%O2低氧培养24h后,我们同样检测到多种miRNAs表达发生变化,其中miR-21、miR-23a的表达明显上调,而miR-143、miR-199a-3p、miR-378的表达明显下调,其中miR-378下调44%。3. miR-378过表达减轻低氧所致心肌细胞损伤和凋亡转染miR-378 mimic (50nM)后,miR-378的表达上调209倍,在低氧培养状态下,细胞上清液LDH活性稍有下降,MDA含量减少27%,细胞活力增加15%,细胞凋亡率减少24%。转染miR-378 inhibitor (50nM)后,miR-378的表达下调52%,在低氧培养状态下,细胞的LDH释放量不变,细胞活力变化不明显,MDA含量增加1.6倍,凋亡率上升1.45倍。4. miR-378靶基因预测和验证Targetscan、Pictar等软件分析miR-378的潜在靶基因发现,caspase-3 (CASP3)的3’非编码区存在miR-378的作用位点,其种子序列匹配较好,且相互作用的序列在物种间具有高度保守性,提示CASP3可能是miR-378的靶基因。但是,我们用real-timePCR法定量检测并没有发现miR-378显著影响CASP3的mRNA水平。考虑到miRNAs的普遍特性(主要从转录后水平抑制靶蛋白生成),我们用Western blot方法分析了CASP3蛋白表达量,结果表明,在低氧培养的H9c2细胞中,转染miR-378 mimic对CASP3蛋白水平无显著影响,而转染miR-378 inhibitor则使得CASP3蛋白水平上调1.5倍。该结果提示CASP3很可能是miR-378的一个靶蛋白。鉴于前述实验结果“缺血/氧状态下心肌细胞miR-378表达下调”,我们推测,缺血心肌miR-378的表达下调有助于CASP3的表达上调而激活,从而促进心肌细胞凋亡。四、结论1.在整体大鼠LAD结扎所致急性缺血心肌模型,缺血4h后,心肌中多种miRNAs的表达发生变化,其中miR-378的表达下调42%。在培养的大鼠H9c2心肌细胞系,低氧培养(1%O2)24h所引起的miRNAs表达变化与在体心肌缺血所引起的变化相似,其中miR-378的表达下调44%。2.在培养的H9c2细胞,过表达miR-378能够减轻缺氧所致细胞损伤和凋亡,相反,miR-378表达缺陷则加重缺氧所致细胞损伤和凋亡。该结果表明,miR-378在缺氧/血状态下具有抑制凋亡、保护心肌的效应。3. MiR-378抑制凋亡、保护心肌的效应很可能是通过抑制靶蛋白CASP3的表达而实现的,有待进一步实验确认。