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本试验由四部分组成,主要研究了中国荷斯坦奶牛FcRn受体α链基因(FCGRT)启动子基因多态性以及体外激素处理对FcRn mRNA表达丰度的影响。以PCR-SSCP方法发现的SNP位点为研究对象,从构建不同单倍型荧光素酶报告基因载体和分析乳腺内FcRn mRNA表达丰度两个方面研究了启动子多态性对转录活性的影响。并且,通过体外激素处理培养的奶牛乳腺上皮细胞,为进一步研究乳腺内FcRn受体变化以及影响因素提供了依据。试验一:以189头中国荷斯坦奶牛为研究对象,对FCGRT启动子采用PCR-SSCP方法进行多态性检测。结果表明:FCGRT启动子在P1、P2和P3引物扩增片段中存在PCR-SCP多态性,位于引物P1扩增产物有AA、AB、BB 3种基因型,其频率分别为25.40%、59.26%、15.34%;引物P2扩增产物有CC、CD、DD 3种基因型,其频率分别为20.63%、56.61%、22.75%;引物P3扩增产物有EE、EF、FF 3种基因型,其频率分别为1.59%、12.17%、86.24%。经克隆测序分析,在三个片段上分别发生了T→C、C→A、G→T的碱基序列突变。经χ2适合性检验,除SNP1外,中国荷斯坦奶牛在该基因位点上的SNP2和SNP3均处于Hardy-Weinberg平衡状态。试验二:构建奶牛FCGRT基因启动子3种不同单倍型荧光素酶报告载体并在293细胞中检测其转录活性。根据奶牛FCGRT基因启动子区2个单个核苷酸多态性(SNPs)位点C-1116T和C-756A,构建出3种单倍型(CC、CA和TA)。分别以CC/CC、CA/CA和TA/TA 3种基因型的奶牛基因组DNA为模板,用PCR法扩增出包含启动子两个SNP位点的长1789bp的DNA片断,利用Kpn I/BgI ll双酶切,纯化回收后分别与同样双酶切的荧光素酶报告基因载体PGL3-Basic相连接,构建CC-PGL3-Basic、CA-PGL3-Basic、TA-PGL3-Basic 3个表达载体,并测序验证其DNA序列。用电穿孔方法将报告基因载体转染至293细胞,采用双荧光素酶报告基因系统评估不同单倍型FCGRT启动子活性。结果表明,试验成功构建含有牛FCGRT基因启动子3种不同单倍型DNA序列的真核表达载体,单倍型CC-PGL3-Basic载体相对荧光检测值显著高于单倍型CA-PGL3-Basic和CA-PGL3-Basic的相对荧光值,单倍型CA-PGL3-Basic相对荧光值又显著高于单倍型TA-PGL3-Basic(P<0.05)。FCGRT启动子不同单倍型载体表达存在差异,SNP影响了FCGRT启动子的转录活性。奶牛FCGRT基因启动子不同单倍型的真核表达载体成功构建,为FCGRT基因启动子功能研究和转录调控奠定了基础。试验三:采集健康中国荷斯坦奶牛乳腺组织,通过测序检测FCGRT启动子单核苷酸多态性,分析各单倍型对表达水平影响,研究中国荷斯坦奶牛FCGRT启动子SNP对FcRn mRNA表达水平的影响。结果表明,不同单倍型中国荷斯坦奶牛乳腺内FcRn mRNA表达水平明显不同。FCGRT启动子单倍型C-C奶牛乳腺中FcRn表达最高,显著高于单倍型T-A和C-A(P<0.05)。单倍型C-A乳腺组织FcRn表达量显著高于单倍型T-A(P<0.05)。FCGRT启动子SNP对FcRn的mRNA的表达有一定的影响,可能会进一步的影响乳腺中FcRn的表达以及对IgG的转运。试验四:以中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞为研究工具,采用了RT-PCR方法检测激素处理对FcRn mRNA表达的影响。本文测定了体外培养乳腺上皮细胞时,添加不同浓度甲状腺素T4(0、0.01、0.1、1μmol/L)、胰岛素(0、0.005、0.1、0.5μmol/L)、胰高血糖素(0、0.01、0.1、1μmol/L)对FcRn mRNA的表达的影响。试验结果表明:随着激素添加剂量的增加,甲状腺素和胰高血糖素能够显著的促进表达量升高(P<0.05),而胰岛素添加后FcRn基因mRNA的表达先升高后降低(P<0.05)。因此,添加外源胰岛素、胰高血糖素和甲状腺素能够影响FcRn基因mRNA的表达,为进一步研究乳腺内FcRn受体变化以及影响因素提供了依据。