论文部分内容阅读
结核病是由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，根据世界卫生组织报告，结核病是由单一感染因素引起的死亡率最高的疾病，但是发生结核菌感染的人群中仅有5～10％发生结核病。大量的遗传学研究表明结核病是多因素共同作用的结果，提示宿主遗传易感性在结核病发生中起着关键作用。结核病易感基因的筛选和确定，不仅是结核病发生高危人群预测诊断和制定相应干预决策的依据，同时也是结核病靶向基因和药物治疗的基础。 白细胞介素6(IL-6)是一种重要的多肽类细胞因子，具有参与调节免疫应答、参与炎症反应等多种功能，现有对于IL-6基因多态性的研究主要集中在风湿性关节炎、心肌炎等炎症疾病。目前国内外还没有关于IL-6基因中任何一个基因多态性与人肺结核易感性的关联分析的报道。 本论文首先根据中国汉族人群对结核菌的暴露率和HapMap数据库中次要等位基因型频率(MAF)，按照预期达到>90％统计效力检验要求，选取了IL-6/IL-6R基因中共11个单核苷酸多态性(SNPs)位点，利用基于单碱基延伸的高通量飞行时间质谱技术(MALDI-TOF)对试验人群(结核病患者495人；健康对照358人)基因分型，比较研究对象在不同组别间SNPs等位基因频率差异。在11个SNPs位点中，位于IL-6基因启动子区域翻译起始位点上游-572位点rs1800796的G等位基因频率在结核病患者中为21.3％，在健康对照中为26.1％，两组之间的差异具有统计学意义(p=0.004，OR=0.716，95％C1=0.570～0.899)，提示rs1800796位点的基因多态性与结核易感性相关。 其次，针对此单一位点扩大样本(病例组1383人，对照组1149人)进行验证。由于是单个位点，我们采用了基于TaqMan探针技术的Real-time PCR进行基因分型。在验证人群中，结核病患者G等位基因频率为20.7％，健康对照为24.6％，两组之间差异具有统计学意义(p=0.0009，OR=0.800，95％C1=0.701～0.913)。将试验人群和验证人群数据合并后，G等位基因频率在结核病患者和健康对照中分别为20.6％和25.1％，两组之间差异仍具有统计学意义(p=0.0001，OR=0.771，95％C1=0.684～0.870)。进一步证实了IL-6基因rs1800796位点等位基因G为保护性基因，与结核病的易感性显著相关。 再次，为了进一步验证rs1800796属于标签SNP或功能性SNP，深入探讨其对基因表达的调节。在血浆水平检测了结核病患者和健康对照中不同基因型IL-6的浓度，结果显示IL-6浓度在结核病患者中高于健康人对照，而且无论是结核病患者还是健康人对照，GG基因型IL-6浓度都有低于CC和GC基因型的趋势，但是差异没有统计学意义。 最后，从健康对照的全血中分离PBMC，使用CD14和CD3荧光标记抗体对PBMC进行染色，借助流式细胞分选技术获得了纯度大于95％的CD19-CD3-CD14+单核细胞并铺于96孔板中培养。细胞分为对照组(Blank)、MTB刺激和19kDa蛋白刺激组，48小时后收集上清，检测IL-6的分泌水平。在细胞水平同样发现GG基因型分泌的IL-6水平低于CC和GC基因型，其中在19kDa蛋白刺激下，GG基因型与其他两组之间差异具有统计学意义。 总之，本论文的研究筛选出了中国汉族人群IL-6基因中与结核易感性相关的SNP；确定了rs1800796位点为功能性SNP；建立了基于MassARRAY质谱技术的预测结核病发生风险的诊断技术。