论文部分内容阅读
本研究采取RT-PCR方法，以从马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒（DLA EIAV）疫苗培养物中提取的RNA作为模板，获得两种编码马传染性贫血病毒反式激活蛋白Tat的基因克隆，分别命名为Etat319和Etat312；然后通过序列比较选取保守克隆Etat319作为模板，再次扩增得到完整的tat基因，所得tat基因全长231bp，编码含76个氨基酸的蛋白。将获得的tat基因克隆到真核表达载体pcDNA3中，得到重组表达质粒tat-pcDNA3，转染实验表明它对EIAV LTR具有反式激活功能。 本研究在健康驴白细胞中比较了D-A EIAV、DLA EIAV及EIAV美国Wyoming株三者之间长末端重复序列（LTR）启动报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）表达的活性差异，以及在EIAV Tat蛋白存在条件下三者受激活时启动CAT表达的活性差异。结果表明在驴白细胞中，DLA EIAV LTR启动CAT表达的活性略高于D-A EIAV LTR；而与EIAV Wyoming株LTR比较，DLA EIAV与D-A EIAV二者LTR启动CAT表达的活性都较低。在共转染重组表达质粒tat-pcDNA3条件下，由于Tat蛋白的激活作用，D-A EIAV及DLA EIAV LTR的起始活性都得到提高，分别提高了4.8倍和6.0倍，而EIAV Wyoming株LTR活性仅提高了3.2倍。 为了验证中国EIAV（DLA EIAV与D-A EIAV）LTR中U3增强子区新发现的GATA基序在病毒转录中的作用，本研究采用PCR定点突变技术将该基序TGATAA突变为TTCGAA，然后转染稳定表达GATA转录因子的K562细胞，检测突变前后U3+R区域启动报告基因表达的差异。结果发现GATA转录因子结合基序突变以后，强弱毒U3+R区域启动报告基因表达的活性分别下降了43％和52％，表明GATA基序在中国EIAV转录过程中起正调控作用，这与在其它反转录病毒基因表达调控中观察到的作用是一致的。 此外，本研究还通过PCR定点突变技术将D-A EIAV TAR元件中的差异碱基按照强毒致弱过程中的改变进行了突变，即将D-A EIAV TAR中的碱基A突变为DLA EIAV相同的碱基G，同时将D-A EIAV TAR相邻区域+3位的碱基A定点突变为与DLA EIAV相同的T。检测结果表明突变前后无明显差异。提示可能由于碱基突变而引起的DLA EIAV TAR二级结构变化在细胞内无法产生，或者即使形成这种增加的小泡，但位于茎部末端，并不能为EIAV Tat蛋白所识别。