目的：创伤愈合包括炎症反应、细胞增殖和组织重建三个互相重叠但又具有不同特点的阶段。其中炎症反应是启动创伤愈合并贯穿于整个过程的关键，增殖期则是通过上皮细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞的增殖和迁移来实施创伤的修复。创伤愈合中的新生血管化由创伤后的炎症介质启动编码的促血管生成因子作用于血管内皮细胞的增殖和迁移而完成，它为创伤部位提供氧、营养和生物活性物质，因此对创伤愈合起到了重要作用。课题组在动物实验中观察到GMCSF基因剔除小鼠创伤后新生血管的生成减少；在野生型小鼠和新西兰兔的创伤模型中发现GMCSF、VEGF与新生血管的形成存在时相性关系；体外实验进一步发现了GMCSF通过激活NF-κB诱导VEGF的蛋白质合成；在前期试验也已验证了GMCSF具有活化NF-κB来诱导VEGF在成纤维细胞内的基因表达和蛋白质合成的作用，本课题将在前期实验的基础上进一步筛选和探讨GMCSF下游和NF-k B上游间的信号通路，以期阐明GMCSF调控创伤愈合中血管新生的分子信号机制。此研究对阐明创伤愈合中新生血管化的细胞和分子生物学机制具有重要的理论创新意义。　　 方法：⑴体外分离培养人皮肤成纤维细胞，应用含不同浓度GMCSF的培养液，孵育离体培养的人皮肤成纤维细胞，作用不同时间后，采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）) 、蛋白质印迹法（Western blot）、酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测人皮肤成纤维细胞VEGFmRNA表达和蛋白表达。⑵筛选出合适浓度的信号特异性抑制剂预处理成纤维细胞，然后再用GMCSF刺激已预处理过的细胞，收集细胞和上清液，采用ELISA的方法或Western blot检测VEGF的含量的变化。如VEGF含量降低，提示该抑制的通路可能参与介导GMCSF受体下游的信号转导，然后采用siRNA技术和Western blot技术检测该信号通路的磷酸化水平来验证该信号。⑶检测该通路是否为介导GMCSF活化NF-κB的信号转导途径。采用研究⑵证实的信号通路抑制剂处理成纤维细胞后，再应用GMCSF处理细胞，通过免疫荧光检测NF-κB的活化情况来证实该信号是否参与了GMCSF活化NF-κB的信号转导。除此外，采用凝胶电泳迁移技术（EMSA）对NF-κB的激活进行分析，以验证该信号是否参与了GMCSF活化NF-κB的信号转导。⑷体外实验验证GMCSF-ERK-NF-κB-VEGF信号通路在调控血管新生中的作用:收集方法⑵中的成纤维细胞上清液，处理有划痕的血管内皮细胞及培养在细胞外基质上的血管内皮细胞，分析其迁移及管腔形成率的变化。　　 结果：①与空白组比较，随着GMCSF浓度的增加VEGF表达量也逐步增加，以50 -100 ng/ml浓度最为显著（P<0.01）；应用50ng/ml的GMCSF作用人皮肤成纤维细胞0、2、4、6、8、12 h后，VEGFmRNA水平于2h开始升高，到4-6h达到峰值，后逐步降低（表达均较对照组显著增强,p<0．05)。Western blot检测示：GMCSF作用12h及24h后，与空白组比较VEGF表达明显增加，以24h为显著（P<0.05）。ELISA检测结果也显示：与空白组比较，GMCSF作用组VEGF蛋白分泌量显著增加（P<0.05），并具有一定的时间依赖性。②PD98059能显著抑制GMCSF诱导人皮肤成纤维细胞VEGF蛋白水平表达的作用，而SB203580、SP600125对GMCSF诱导人皮肤成纤维细胞内VEGF蛋白水平的表达无显著差异（P>0.05）；通过SiRNA干扰ERK信号通路后，与阴性对照比较，转染ERK组其VEGF蛋白表达显著减少（P<0.05），而阴性组与空白组之间比较，VEGF表达无显著差异（P>0.05）。另外，GMCSF能够显著活化ERK磷酸化过程。③通过应用PD98059抑制ERK信号通路后，免疫荧光显示：与GMCSF组比较，PD98059+GMCSF组处理的成纤维细胞其NF-κB活化显著被抑制；另外我们通过EMSA技术也证实，抑制ERK 信号通路后，NF-κB的活化被显著抑制。④体外血管内皮细胞迁移实验显示，与空白组比较，GMCSF能显著促进血管内皮细胞的迁移（P<0.05）；而抑制ERK通路或NF-κB后，迁移距离显著缩短（P<0.05）。体外管腔形成实验显示，与空白组比较，GMCSF能显著促进管腔的形成；而抑制ERK通路或NF-κB后，管腔结构显著减少（P<0.05）。　　 结论：⑴GMCSF能够显著诱导人皮肤成纤维细胞VEGF的表达，且具有剂量及时间依赖性；⑵GMCSF可经ERK信号通路调控VEGF在成纤维细胞中的表达；⑶GMCSF可经ERK信号通路活化NF-κB诱导VEGF在成纤维细胞中表达；⑷体外实验证实GMCSF-ERK-NF-κB-VEGF信号通路在调控血管新生中起着重要作用。