一、研究背景胰腺癌是一种临床表现隐匿、发展迅速、预后很差的消化道恶性肿瘤,其早期诊断困难,死亡率高。大部分患者就诊时已属晚期,手术切除率仅10%-15%,5年生存率仅为1%-5%。目前化疗仍是胰腺癌辅助治疗的重要手段之一,但现有的化疗药物容易产生耐药。因此,国内外大量学者越来越热衷于天然植物抗癌成分的研究,希望能够提高胰腺癌患者的生存期并使患者受益。花姜酮是从球姜中提取的倍半萜类化合物,已被证明具有抗炎、抗肿瘤等多种生物活性,尤其是花姜酮的抗肿瘤作用及其机制越来越受到学者的关注。花姜酮抗肿瘤作用的分子生物学机制方面已取得了一些进展。有研究证实,花姜酮能通过抑制各种致癌物质引起的NF-kappaB及其相关基因的表达,从而起到预防和治疗癌症的作用；Sakinah SA等研究发现,花姜酮能够通过调节Bax/Bcl-2比率来诱导肝癌细胞凋亡。但是关于花姜酮抗胰腺癌作用机制的研究尚浅,其详细机制还有待深入研究。信号转导与转录激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)是一组能与DNA结合的蛋白质,介导多种细胞因子和生长因子向细胞核内传导,影响靶基因的转录,调节人体免疫反应、炎症反应和细胞的生长、分化等[6]。大量研究证明STAT家族在胰腺癌以及其它多种肿瘤的发生发展过程中起到了重要的作用,并且通过增强或抑制STAT的活性,影响多种癌细胞系的增殖和凋亡。STATs家族包括有7个成员,分别是STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT6、STAT5a和STAT5b。STAT1-/-小鼠的基因不能被IFN-α和IFN-β激活,因此IFN反应的损失更为严重,极易引起肿瘤和感染。较野生型小鼠相比,STAT1/IFN-γ敲除小鼠通过化学诱导产生肿瘤的速度更快,频率更高。通过复习与本研究相关的文献资料发现,目前关于花姜酮对胰腺癌细胞作用的具体机制研究尚浅,并且对于花姜酮在胰腺癌治疗中的应用价值暂无实验研究方面的依据。针对上述现状,设计本课题拟研究一下两方面问题：首先,花姜酮对于胰腺癌细胞的生长作用的机制中,STAT1是否参与其过程?其次,花姜酮对于在体胰腺癌细胞是否具有抗癌治疗作用,临床应用中是否可以将花姜酮作为胰腺癌的辅助治疗?二、研究目的1.研究花姜酮对胰腺癌PANC-1细胞生长的作用机制；2.探讨花姜酮在胰腺癌治疗中的应用价值。三、研究方法1.不同浓度(0、3.75、7.5、15、30和60μg/ml)的花姜酮,分别干预0、12、24及48 h后,CCK-8法检测细胞增殖抑制率变化。不同浓度(0、7.5和15μg/ml)的花姜酮干预24 h后,Hoechst33258染色法及流式Annexin V-FITC/PI法检测PANC-1细胞凋亡情况；Western blotting方法检测p- Stat1、Bax(?)口Bcl-2的表达水平的变化。2.将人胰腺癌PANC-1细胞(5×106,重悬于100μL PBS溶液中)接种于裸鼠右侧背部皮下。10d后,将裸鼠随机分为3组,阴性对照组,低剂量组和高剂量组。阴性对照组为DMSO组,低剂量组为花姜酮(20 mg/kg)组,高剂量组为花姜酮(40mg/kg)组,每隔4d行瘤内注射,并用游标卡尺测量瘤体长径和宽径,接种后26 d处死裸鼠。观察裸鼠状态和移植瘤的生长状况；称量瘤重；TUNEL方法检测细胞凋亡情况。四、结果1.不同浓度(0、3.75、7.5、15、30和60μg/ml)的花姜酮干预PANC-1细胞24h后,不同浓度作用下的细胞抑制率分别为：(1.1±0.12)%、(3.0±0.41)%(4.3±0.53)%、(53.7±2.72)%、(78.6±2.85)%及(79.6±2.98)%,细胞增殖抑制率呈剂量依赖性增高,差异有统计学意义(P<0.05)。浓度为15μg/ml的花姜酮干预0、12、24及48 h后,PANC-1细胞抑制率呈时间依赖性增高,差异有统计学意义(P<0.05)。Hoechst33258染色法结果表明,经花姜酮干预后的PANC-1细胞的凋亡率明显高于未经花姜酮干预的细胞,差异有统计学意义(P<0.05),且高浓度组细胞的凋亡率亦明显高于低浓度细胞,呈浓度依赖性增高。流式Annexin V-FITC/PI法结果显示高剂量组细胞凋亡率(54.3+7.5)%,与低剂量组细胞(5.9±1.1)%和阴性对照组细胞(1.1±0.4)%相比,差异有统计学意义(P<0.01),而低剂量组凋亡率较阴性对照组细胞凋亡率增高,差异有统计学意义(P<0.01)。以上结果表明过花姜酮可以抑制人胰腺癌细胞的增殖,促进细胞的凋亡。(?)Vestern blotting法检测结果表明,高剂量组细胞,与低剂量组和阴性对照组细胞相比,p-Statl表达增强,Bax蛋白表达增强,Bcl-2表达降低,Bax/Bcl-2比值明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),而低剂量组细胞较阴性对照组细胞,其表达有显著性差异(P<0.05)。以上结果表明STAT1信号通路可能参与了花姜酮诱导人胰腺癌PANC-1细胞凋亡的过程。2.花姜酮瘤内注射后,与未注射花姜酮裸鼠相比,PANC-1细胞皮下移植瘤生长速度较慢、体积较小,差异有统计学意义(P<0.05)；而高剂量组与低剂量组相比较,瘤体生长速度亦明显较快(P<0.05)。瘤体TUNEL检测结果显示,未干预组PANC-1细胞棕黄色核较少,而干预组PANC-1细胞棕黄色核较多,差异有统计学意义(P<0.01),高剂量组凋亡指数亦高于低剂量组,差异具有统计学意义(P<0.01)。五、结论在体外实验中,花姜酮抑制了人胰腺癌PANC-1细胞的增殖,促进了细胞的凋亡,STAT1信号通路可能参与了此过程。在体内实验中,花姜酮可以有效的以凋亡方式抑制人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长。基于以上研究结果,我们为临床上治疗胰腺癌找到了一条新的潜在途径。