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第一部分Ras1、Cdc42、Rac1、Rho1基因在阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相中的表达差异目的Ras1、Cdc42、Rac1、Rho1基因在真菌细胞极性生长、形态转换中有重要作用。本实验通过研究观察获得阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii, T.asahii)的酵母相和菌丝相,采用实时荧光定量PCR方法测量Ras1、Cdc42、Rac1、Rho1基因在阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相中mRNA表达量,获得这些基因在阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相中的表达差异,以初步探讨Ras1、Cdc42、Rac1、Rho1基因在阿萨希毛孢子菌菌相转换中的作用。方法1.采用玉米琼脂培养基、35℃静置培养1d、2d、5d、10d,比较观察酵母相的形成,并统计菌丝生成率；采用RPMI-1640液体培养基、37℃、150r/min震荡培养4h、8h、12h、24h,比较观察菌丝相的形成,并统计菌丝生成率。2.收集酵母相和菌丝相的菌悬液,分别提取总RNA,并通过逆转录合成第一链cDNA。3.应用实时荧光定量PCR法检测酵母相和菌丝相中Ras1、Cdc42、Rac1、 Rho1基因的mRNA表达情况。4.统计学处理：所有数据采用SPSS13.0统计软件分析处理,计量资料以均数±标准差表示。两独立样本间比较采用两独立样本t检验,实时荧光定量法数据结果采用相对定量基因表达分析,按α=0.05检验水平,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.酵母相和菌丝相诱导结果显示：玉米琼脂培养基、35℃静置培养5d,可获得足量较纯酵母相,菌丝生成率为(O.40±0.53)%;RPMI-1640液体培养基、37℃.150r/min震荡培养24h可获得足量较纯菌丝相,菌丝生成率为(99.33±0.57)%。将酵母相和菌丝相两组菌丝生成率进行t检验,t=13.93,P<0.05,差异有统计意义。2.目的基因和内参基因的溶解曲线和扩增曲线分析结果显示：基因溶解温度均一,扩增特异性好,未见非特异的双链DNA产物或引物二聚体。因此,可采用SYBRI法进行相对定量分析。扩增曲线均光滑平稳,荧光吸收图谱的S形曲线形状完整,符合定量检测要求。3.Ras1、Cdc42、Rac1、Rho1基因在酵母相和菌丝相中表达量显示：(1)Ras1基因的表达差异：以酵母相为对照组,Ras1基因表达量设为1,则菌丝相中的Ras1表达水平明显增高,为其25.17倍,两组进行t检验,t=3.81,P<0.05,差异有统计意义,故在酵母相和菌丝相中,Ras1基因的mRNA表达有差异。(2)Cdc42基因的表达差异：以酵母相为对照组,Cdc42基因表达量设为1,则菌丝相中的Cdc42表达水平明显增高,为其14.68倍,两组进行t检验,t=3.63,P<0.05,差异有统计意义,故在酵母相和菌丝相中,Cdc42基因的mRNA表达有差异。(3)Rac1基因的表达差异：以酵母相为对照组,Rac1基因表达量设为1,则菌丝相中的Rac1表达水平明显增高,为其16.81倍,两组进行t检验,t=3.51,P<0.05,差异有统计意义,故在酵母相和菌丝相中,Racl基因的mRNA表达有差异。(4)Rhol基因的表达差异：按照相对定量表达测定法,以酵母相为对照组,Rho1基因表达量设为1,则菌丝相中的Rho1表达水平明显增高,为其42.61倍,两组进行t检验,t=3.90,P<0.05,差异有统计意义,故在酵母相和菌丝相中,Rhol基因的mRNA表达有差异。第二部分Cdc42、Rho1基因在阿萨希毛孢子菌不同菌相中的表达差异目的Cdd42、Rho1基因在阿萨希毛孢子菌酵母相和菌丝相中表达有显著差异。本实验旨在通过不同培养时间下获得阿萨希毛孢子菌标准株不同菌悬液,且通过培养4株不同来源的菌株,分别测量标准株不同培养时间下Cdc42、Rho1基因的表达差异,以及在4株不同来源菌株中Cdc42、Rho1基因的表达差异。进一步验证其在阿萨希毛孢子菌菌相转换中的作用。方法1.采用YPD液体培养基,37℃、150r/min震荡培养阿萨希毛孢子菌标准株CBS2479,分别培养3h、6h、12h、20h,以获得标准株不同培养时间下的菌悬液；收集4株不同来源阿萨希毛孢子菌菌株,采用YPD液体培养基,37℃、150r/min震荡培养24h,以获得不同来源菌株相同培养条件下的菌悬液。分别比较观察菌丝生成情况并统计菌丝生成率。2.收集各条件培养下的菌悬液,分别提取总RNA,并通过逆转录合成第一链cDNA。3.应用实时荧光定量PCR法检测各条件培养下的不同菌悬液中Cdc42、Rho1基因的mRNA表达情况。4.统计学处理：所有数据应用SPSS13.0统计软件分析处理,计量资料以均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析,实时荧光定量法数据结果采用相对定量基因表达分析,按α=0.05检验水平,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.标准株不同培养时间下菌丝诱导结果显示：3h菌丝生成率为(9.00±3.61)%：6h菌丝生成率为(36.00±5.29)%；12h菌丝生成率为(77.67±6.81)%；20h菌丝生成率为(44.00±5.29)%。各时间点菌丝生成率进行单因素方差分析,组间比较有显著差异(F=83.26,P<0.05),多重比较法分析,除6h与20h比较无显著差异外(P>0.05),余各组间差异均有统计意义(P<0.05)。2.不同来源菌株菌丝诱导结果显示：环境株CBS8904菌丝生成率为(1.75±0.43)%；临床株BZP09001菌丝生成率为(57.20±7.52)%；标准株CBS2479菌丝生成率为(72.26±5.73)%；环境株CBS8520菌丝生成率为(97.00±4.36)%。不同来源菌株菌丝生成率进行单因素方差分析,组间比较有显著差异(F=235.64,P<0.05),多重比较法分析,各组间差异均有统计意义(P<0.05)。3.目的基因和内参基因的溶解曲线和扩增曲线分析结果显示：基因溶解温度均一,扩增特异性好,未见非特异的双链DNA产物或引物二聚体。因此,可采用SYBRI法进行相对定量分析。扩增曲线均光滑平稳,荧光吸收图谱的S形曲线形状完整,符合定量检测要求。4.Cdc42、Rho1基因在不同菌相中表达量显示：(1)不同培养时间下Cdc42基因的表达差异：以3h为对照组,表达量设为1,则6h表达量为其10.16倍,12h表达量为其20.10倍,20h表达量为其5.89倍,多组进行单因素方差分析,组间比较有显著差异(F=13.15,P<0.05),多重比较法分析,其中3h表达量显著低于12h表达量(P<0.05),余各组间表达量比较无统计意义(P>0.05)。(2)不同来源菌株Cdc42基因的表达差异：以BZP09001为对照组,表达量设为1,则CBS8904表达量为其0.30倍,CBS2479表达量为其1.73倍,CBS8520表达量为其4.07倍,多组进行单因素方差分析,组间比较有显著差异(F=12.11,P<0.05),多重比较法分析,其中CBS8520表达量显著高于其余各组表达量(P<0.05),余各组间表达量比较无统计意义(P>0.05)。(3)不同培养时间下Rho1基因的表达差异：以3h为对照组,表达量设为1,则6h表达量为其2.79倍,12h表达量为其5.10倍,20h表达量为其2.10倍,多组进行单因素方差分析,组间比较有显著差异(F=39.98,P<0.05),多重比较法分析,除6h与20h表达量比较无显著差异外(P>0.05),余各组间表达量比较均有统计意义(P<0.05)。(4)不同来源菌株Rho1基因的表达差异：以BZP09001为对照组,表达量设为1,则CBS8904表达量为其0.40倍,CBS2479表达量为其1.24倍,CBS8520表达量为其2.75倍,多组进行单因素方差分析,组间比较有显著差异(F=30.16,P<0.05),多重比较法分析,其中CBS8520表达量显著高于其余各组(P<0.05),CBS2479表达量显著高于CBS8904表达量(P<0.05),余各组间表达量比较均无统计意义(P>0.05)。结论1.玉米琼脂培养基、35℃静置培养5d,可获得阿萨希毛孢子菌酵母相；RPMI-1640液体培养基、37℃震荡培养24h,可获得阿萨希毛孢子菌菌丝相,方法简便易行。2.不同培养条件下,阿萨希毛孢子菌菌丝生成率不同,说明培养基和培养时间可以影响阿萨希毛孢子菌的菌丝形成,且不同来源菌株在相同培养条件下菌丝生成率也不同,说明菌丝生成与菌株来源也密切相关。3.在酵母相和菌丝相中,阿萨希毛孢子菌的Ras1、Cdc42、Rac1、Rho1基因皆有表达,但在酵母相中只有少量表达,转化为菌丝相后表达量明显增加,说明Ras1、Cdc42、Rac1、Rho1基因并非阿萨希毛孢子菌的菌丝特异基因,但在促进阿萨希毛孢子菌的细胞极性生长、菌丝生成方面可能发挥作用。4.不同培养时间下,阿萨希毛孢子菌菌丝生成率不同,且随着菌丝生成率的升高,Cdc42、Rho1基因的表达量也升高,进一步说明Cdc42、Rho1是参与阿萨希毛孢子菌标准株从酵母相向菌丝相转化调控的基因,在其菌相转化中可能起着重要作用。5.不同来源菌株菌丝生成率也不同,且随着菌丝生成率的升高,Cdc42、Rho1基因的表达量也升高,且CBS8904菌株基本为酵母相,而CBS8520菌株基本为菌丝相,两者Cdc42、Rho1基因表达量差异显著,从另一方面说明Cdc42、Rho1基因与阿萨希毛孢子菌的菌丝生长相关。因Rac1、Ras1与Cdc42、Rho1同属于Ras家族蛋白,推测Ras1、Cdc42、Rac1、Rho1在阿萨希毛孢子菌菌相转换中可能发挥作用。