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根结线虫(Meloidogyne spp.)是专性植物寄生性病原生物,在根部侵染过程中对植物本身的基因进行调控,以诱导植物细胞特化,形成特化的取食结构,危害2000多种植物;病害发生后,一般减产10%-20%,严重的达75%以上;有证据表明,每年导致农作物和植物的损失超过1000亿美元。近年来,随着对线虫侵染方式,植物自身抗病防御体系研究的不断深入,以及分子生物学理论和生物工程技术的不断发展,为利用植物自身防御体系及线虫自身生理生化特点,通过基因工程手段,建立一个具有高效、经济、环保的线虫综合控防策略成为可能。为此,我们开展了抗根结线虫基因工程的研究。本文主要研究结果如下:1克隆了受根结线虫诱导的根结特异性表达的启动子RKNIP,登陆GenBank号为DQ486886,模序分析表明,RKNIP500具有双向启动子的功能,而RKNIP300不具有启动子的功能,但是存在大量的与启动子功能相关的元件,特别是具有25个在根内特异性表达的元件。该启动子诱导抗根结线虫基因在根结内表达,可是作物达到抗根结线虫的目的。2参照NCBI GenBank (accession number AF435976 ) OC-I序列,合成7条引物,并且设计突变位点,然后利用重叠延伸技术,克隆了完整的OC-I-Δ-D86突变基因。参照GenBank (DQ087264)公布的16D10编码序列,设计了2条寡核苷酸序列用于合成16D10基因的双链干扰序列,克隆进了T载体中,命名为pGEM-T-RKNIP300-16D10-33(简写为pTT33)。3为了便于研究抗线虫基因功能表达的差异研究,构建了四个植物表达载体,分别为pRTO、pRO、pRT33、pRTOT33。其中pRTO为TobRB7Δ0.3:OC-I-ΔD86;pRO为CaMV35S:OC-I-ΔD86 ;pRT33为TobRB7Δ0.3: 16D10-33;pRTOT33为CaMV35S: OC-I-ΔD86与TobΔ0.3:16D10-33的双价基因载体系统。为抗根结线虫植物基因工程的遗传转化研究打下了基础。4将OC-IΔD86基因克隆到原核表达载体pet21b中,在1mmol/L的IPTG诱导后5h,OC-IΔD86融合基因在大肠杆菌中得到表达,表达产物处于可溶状态,其表达量占总蛋白的11.4%,可溶性蛋白的16.4%;利用Ni-NTA系统纯化该蛋白并经PEG20000浓缩;活性分析表明该蛋白酶抑制剂在体外表现出对木瓜蛋白酶明显的抑制作用;制备了效价大于10000的鼠抗血清。这为抗根结线虫基因(OC-IΔD86)的转基因植株的验证奠定了基础。5通过农杆菌介导法,将三个载体pRTO、pRT33、pRO,分别转入烟草,其中pRTO、pRO获得了发育正常的再生植株;而转pRT33基因的烟草表型发生变化,表现为叶片由椭圆形变为柳叶形,且叶片丛生,叶色黄花,不能发育成正常植株。对转pRTO基因的烟草植株进行了PCR、SOUTHERN、ELISA检测及表型检测,证明pRTO基因已成功转入烟草中,并表达出了抗性蛋白,转基因植株表现了明显的抗根结线虫的效果。6黑籽南瓜是一种非常优良的瓜类嫁接砧木材料,单是不抗根结线虫。为了使其获得抗根结线虫的特性,首先开展黑子南瓜再生体系的研究。结果表明:以子叶为外植体,基本培养基为MS,合适的芽诱导激素浓度为BA (2.0mg/l)、TDZ (1.0mg/l)、ZT (2.0mg/l),不定芽再生率分别为91.67%、98.33%、91.67%,KT诱导效果较差;合适的芽伸长培养基为MS+0.25mg/L KT,80%-100%的诱导芽可以发育成正常的芽;合适的生根培养基MS+0.1 mg/l IAA,生根率为100%;驯化移栽后成活率为85%,成功建立了黑籽南瓜不定芽再生体系。利用黑籽南瓜成熟胚为外植体,MS+TDZ0.5mg/L培养基成功建立了黑籽南瓜成熟胚再生体系。以上研究为黑籽南瓜的遗传转化提供了前提条件。