由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的黄萎病是棉花的主要病害之一,它严重影响了棉花的生产。本实验室武翠红硕士分离筛选出了一株对大丽轮枝菌有较强抗菌活性的新菌株—解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)RS-25,对此菌株的蛋白进行了分离纯化,得到表观分子量为9 kD的单一活性组分,命名为A2,EDMAN降解法测得其N端序列为ASGGTVGIYGANMRS。本论文在此工作基础上进行后续研究,重点研究了棉花黄萎病抗菌肽全长基因和成熟肽基因的克隆及在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达。将A2的N端15个氨基酸在NCBI上进行比对,结合菌株的16S rDNA结果,得到一段100%同源蛋白序列。根据此同源蛋白对应的编码序列对新型抗菌肽全长基因进行引物设计,构建重组质粒pET-30a-a2q1,并对其进行了测序。结果表明:此抗菌肽基因a2q1全长354 bp,编码117个氨基酸,其中第42~56位氨基酸与武分离纯化的抗菌肽A2的N端15个氨基酸完全相同。本研究得到的蛋白在N端比抗菌肽A2多出41个氨基酸,分析这41个氨基酸可能起调控作用,而武分离纯化的抗菌肽A2为成熟肽。将重组质粒pET-30a-a2q1利用热激转化法转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后,SDS-PAGE显示胞内具有目的条带,表达产物表观分子量为19 kD。用镍柱亲和层析的方法对表达蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示在19 kD有单一条带。大丽轮枝菌抑菌试验检测,发现其无抑菌活性。本研究克隆表达的目的蛋白A2Q1比武分离纯化的抗菌肽A2多41个氨基酸,为验证是否是此41个氨基酸影响蛋白活性,以及获得具有抗菌活性的重组蛋白,对成熟肽片段进行了研究。对成熟肽基因设计引物,构建重组质粒pET-30a-a2c,转化大肠杆菌BL21,经诱导表达,镍柱亲和层析,SDS-PAGE显示在14 kD有单一条带,由于成熟肽A2C与载体His标签融合,故表观分子量比武分离纯化的抗菌肽A2(9 kD)略大。经检测,发现A2C也无抑菌活性。综上分析可能是由于抗菌肽A2为糖蛋白(武报道),而大肠杆菌表达系统缺乏糖基化功能,所以表达的蛋白A2Q1、A2C没有活性。酵母表达系统具有糖基化功能,故选取毕赤酵母表达系统进行以下研究。对全长基因设计引物(引入组氨酸标签),构建重组质粒pPIC9K-a2q2,线性化后,用电击转化法转化毕赤酵母GS115,经甲醇低温诱导,镍柱亲和层析,SDS-PAGE显示在19 kD有单一条带。经检测,发现表达蛋白A2Q2有抑菌活性。由此说明,本研究克隆表达的蛋白质,需经过糖基化,才能发挥抑菌活性,进一步验证其为糖蛋白。本试验成功对抗菌肽A2进行了克隆表达,表达产物有拮抗大丽轮枝菌的活性。这不仅为研究棉花黄萎病抗菌肽的功能、作用机理提供了一定的研究材料,更进一步为转基因棉花及棉花抗病基因工程等方面的研究奠定了必要的理论与实践基础。