脑卒中是脑血管发生缺血性或出血性病变所致的一类脑部疾病,具有发病率、死亡率与致残率高等特点。从全球范围内看,中国依旧是脑卒中的高发地区。脑卒中可分为缺血性脑卒中、出血性脑卒中,其中缺血性脑卒中占卒中发病率的80%以上,因此我们的研究主要围绕缺血性脑卒中开展。至今为止,重组组织型纤维蛋白酶原激活剂（tissue plasminogen activator,tPA）是唯一经过美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准用于临床缺血性脑卒中溶栓治疗的药物,但是其存在治疗时间窗窄、不良反应多等缺点,这些不利因素限制了它在临床中的使用。目前,临床上依旧缺乏切实有效的脑卒中治疗药物。微小RNAs（microRNAs,miRNAs）作为一种重要的基因表达调控因子,参与了生命过程中一系列的重要进程。近年来,对miRNAs与脑卒中相关的研究越来越多,研究表明miRNAs可参与脑卒中的病理发展。其中microRNA-98作为miRNAs家族一员,参与了结肠癌、心肌炎等多种疾病过程。神经炎症是脑卒中损伤的病理机制之一。小胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system,CNS）内的免疫效应细胞,在脑内微环境中发挥免疫监视作用,能对中枢神经系统损伤做出相应反应,因此小胶质细胞在中枢神经系统稳态的维护及损伤的修复方面起到了极其重要的作用。本文工作在实验室前期工作发现microRNA-98与缺血性脑卒中具有相关性的基础上,进一步研究microRNA-98对缺血性脑卒中大鼠的实验治疗作用及机制。主要内容包括:制备短暂性大脑中动脉栓塞（transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO）大鼠模型,评价microRNA-98对缺血性脑卒中模型大鼠的治疗效果;离体培养原代大鼠小胶质细胞、建立氧糖剥夺/复糖复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）模型,初步探索 microRNA-98对缺血性脑卒中的保护作用机制。本研究拓展了 microRNA-98的药理学新用途,为其向脑卒中治疗药物的转化提供了实验资料和理论依据。研究目的:研究microRNA-98对局灶性脑缺血再灌注所致大鼠损伤的保护效应,初步阐明microRNA-98对缺血再灌注所致炎性损伤的调控机制。研究方法:1.应用线栓法建立大鼠tMCAO模型,缺血90分钟后,拔除栓线恢复血供;2.应用 2,3,5-三苯基氯化四唑（2,3,5-triphenyl four azole nitrogen,TTC）染色测定脑梗死体积;3.应用Longa行为学实验方法评价动物的神经功能障碍;4.应用RT-qPCR检测白介素-1β（Interleukin-1 beta,IL-1β）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor,TNFα）、高迁移率族蛋白 1（high mobility group box-1 protein,HMGB1）、诱导型氮氧化合物（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）等炎症因子的mRNA水平的变化;5.应用 Western bloting 检测血小板活化因子受体（platelet activating factor receptor,PAFR）、iNOS、转化生长因子 β（transforming growth factor-β,TGF-β）、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶（phosphorylation mitogen-activated protein kinase,pP38 MAPK）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,P38 MAPK）、磷酸化 Jun 氨基末端激酶（phosphorylation Jun N-terminal kinase,pJNK）、Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase,JNK）等蛋白的表达;6.应用免疫组织化学染色法观察缺血脑组织缺血半影区星形神经元与星形胶质细胞的形态与数量的改变;7.应用免疫荧光检测小胶质细胞M1/M2表型变化;8.应用荧光素酶报告基因法检测microRNA-98对PAFR的靶向调节。研究结果:一、在体研究结果1.MicroRNA-98与缺血性脑卒中存在相关性通过对脑卒中患者血清样本的检测发现,卒中患者血清中microRNA-98的含量较正常对照人群有显著性降低;在缺血性脑卒中动物模型中,我们也发现在缺血再灌24h至3天内,大鼠脑内的microRNA-98含量较伪手术组显著性降低。2.MicroRNA-98减小缺血再灌注模型大鼠的脑梗死体积、减轻神经功能障碍大鼠的神经功能评价结果显示,microRNA-98治疗组大鼠的运动功能障碍较模型组有显著减轻;应用TTC染色的结果显示,模型大鼠在缺血再灌后的脑梗死率为24.59%,而给予microRNA-98干预可减小脑梗死体积、梗死率仅为14.54%,相较于模型组其梗死率降低10.05%。3.MicroRNA-98减轻神经元损伤、抑制星形胶质细胞活化、促进小胶质细胞向M2型转变应用免疫组化染色观察大鼠脑内神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞形态及数量的变化,结果显示;模型组中可见神经元数量明显减少、胞体减小、核膜固缩及星形胶质细胞有异常增殖活化,小胶质细胞中M1型标记物含量增加;给予microRNA-98干预后可明显减少神经元丢失并缓解核固缩现象,抑制星形胶质细胞增殖活化并促进小胶质细胞向M2型转变。4.MicroRNA-98减轻神经炎症反应、减少炎症因子释放（IL-1β、HMGB1、iNOS、TNF-α）mRNA水平检测结果显示,在缺血半影区内,模型组大鼠较假手术组IL-1β、HMGB1、iNOS、TNF-α释放显著增加,给予microRNA-98干预则使上述因子表达减少;蛋白表达检测结果同样显示,在缺血半影区内,模型大鼠较假手术组IL-1β和iNOS表达增加,microRNA-98干预后使这两种炎症因子的表达均降低。5.MicroRNA-98抑制缺血再灌注后大鼠脑内JNK/P38 MAPK信号通路的活化WB结果显示,与假手术组相比,模型大鼠缺血半影区组织中的JNK和P38 MAPK磷酸化水平显著升高,转染microRNA-98可抑制JNK及P38 MAPK的磷酸化。二、离体研究结果:1.MicroRNA-98靶向抑制小胶质细胞内PAFR蛋白的表达我们通过生物信息学手段预测microRNA-98的靶基因,并应用荧光素酶报告基因法检测发现,microRNA-98负性调节靶基因PAFR的表达;OGD可致原代培养的小胶质细胞中PAFR表达上调,转染microRNA-98 agomir则显著抑制PAFR蛋白的表达。2.MicroRNA-98促进小胶质细胞向M2型转变应用WB检测发现,OGD使小胶质细胞内M1型标记物iNOS表达增加而M2型标记物TGF-β表达减少;与模型组相比,转染microRNA-98使小胶质细胞内M1型标记物减少、M2型标记物TGF-β表达增加。3.MicroRNA-98抑制OGD后小胶质细胞内JNK/P38 MAPK信号通路的活化WB结果显示,OGD组原代小胶质细胞中JNK和P38 MAPK的磷酸化水平显著升高,转染microRNA-98可显著抑制JNK及P38 MAPK的磷酸化。结论:1.MicroRNA-98与缺血性脑卒中相关;2.MicroRNA-98能够减轻神经元损伤,抑制星形胶质细胞异常活化与增殖,促使小胶质细胞向M2型转变,抑制神经炎症反应,进而发挥对缺血再灌注所致大鼠脑损伤的保护作用;3.MicroRNA-98靶向负性调节PAFR的表达,进而抑制PAFR下游JNK/P38MAPK炎症相关的信号通路的激活。本文工作的主要创新之处:1.发现microRNA-98与缺血性脑卒中的相关性;2.揭示microRNA-98对缺血性脑卒中损伤的保护作用;3.阐明microRNA-98通过靶向抑制PAFR表达及其相关炎症信号通路,发挥其抗神经炎性损伤的作用。