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根据GenBank中人TRAIL基因编码的氨基酸序列(编码第111-281位氨基酸),按照大肠杆菌密码子偏好性原则,设计24条用于基因拼接的正反链DNA引物,在首尾引物的5’端和3’端分别带有便于与载体连接的EcoRI和XhoI酶切位点。以引物自身为模板,进行四轮PCR扩增,得到的513bp的目的基因的DNA片段,将得到的目的DNA片段插入到表达载体PET23a上,将筛选获得的重组载体送去上海英骏公司测序,将序列完全正确的重组载体DNA转化E.coliBL21(DE3)。克隆的TRAIL基因成功地在大肠杆菌中表达。实验显示:在17℃条件下,使用0.5MmIPTG诱导10小时,TRAIL蛋白表达量达到最大。为了分离纯化TRAIL蛋白,首先利用40％-60％硫酸铵进行分级分离。然后利用CM Sepharose阳离子交换柱进行离子交换层析,再利用Butyl-Sepharose4B进行疏水层析。经过三种不同方法的分离与纯化,目的蛋白在13％的SDS-PAGE上只显示一条带,即达到电泳纯。从1L菌液纯化得到6.2mg纯净的TRAIL蛋白。
纯化后的TRAIL蛋白以肝癌细胞株HepG-2为作用对象,通过观察细胞形态,MTT法和DNA凝胶电泳法鉴定了TRAIL蛋白的活性。MTT结果显示,TRAIL可明显抑制HepG-2细胞增殖,并具有显著的量效关系,即抑制率随着剂量的增加而增大。当TRAIL浓度为1000ng/ml时,抑制率达到最大为80％。细胞形态观察结果显示,1000ng/ml的TRAIL处理24h时,细胞质浓缩,大量细胞脱落并悬浮于培养液中。诱导过程中细胞总DNA检测结果显示,细胞经过TRAIL蛋白诱导产生了典型的DNA梯形条带,证实细胞的确产生凋亡。
本实验采用了TRAIL分别与三种天然药物联合作用于HepG-2的方法来判断两者之间是否存在着协同作用。MTT结果显示,当TRAIL与白藜芦醇联合作用时,对HepG-2的抑制效应只是两者单独作用时的叠加值;当TRAIL与姜黄素共同作用时,对HepG-2的抑制率比叠加值对照略微偏高,提示两者联合作用有可能产生了一定的正向协同效应;当TRAIL与芍药醇联合作用于HepG-2时,联合作用的抑制率普遍比对照值还要低,提示芍药醇与TRAIL的联合作用有可能对TRAIL产生了一定的拮抗作用。