禽网状内皮组织增生症(Reticuloendotlleliosis,RE)是由禽反转录病毒属的网状内皮组织增生症病毒(REV)所引起的一组病理综合征,可引起禽类肿瘤和免疫抑制性疾病,干扰其他的免疫效应,导致免疫失败,并容易导致不同程度的二重感染、多重感染和继发感染,加剧某些疾病的临床表现,使疫病的诊断和防控难度加大。目前,对禽网状内皮组织增生症尚无有效的疫苗和药物进行预防和治疗,国内外主要通过抗原／抗体检测,淘汰患病鸡净化种群的方式来控制这种肿瘤病的发生为了进一步了解我国REV的流行情况,及早淘汰REV阳性鸡,间接ELISA检测REV抗体最适于临床检测。但国内至今还未见REV抗体检测试剂盒的相关专利;国外特异性检测REV抗体检测试剂盒虽已经商品化,但由于价格昂贵,很难大范围使用。因此,建立具有我国自主知识产权的ELISA抗体检测试剂盒显得尤为重要。REV-env基因编码的gp90C末端表位位于感染细胞的表面,含有顺序和构象表位,是病毒的免疫显性蛋白,能够激发感染宿主产生中和抗体;因此REV的ENV蛋白被认为是一种应用于REV诊断的良好选择。本课题以REV原型株SNV株为标准株,用特异性引物扩增出1200bp相对保守的env基因序列,该段基因包含了REV病毒90%以上的抗原位点,既保证了基因的保守性又保留了良好的抗原性。将扩增出的基因片断与表达载体pET-28a连接组成重组质粒pET-28a-env,将重组质粒转化入BL21宿主菌,优化诱导表达条件,表达产物经SDS-PAGE电泳,显示蛋白以包涵体的形式存在,在45KD处出现目的蛋白。采用尿素法纯化大量表达的蛋白包涵体,通过透析法恢复蛋白的天然构象和蛋白活性。测定纯化蛋白浓度后进行ELISA和Western-blot检测,结果显示ELISA检测灵敏性能达到100ng/mL,表达的蛋白具有良好的灵敏性和特异性。将纯化的目的蛋白倍比稀释后包被ELISA板,4℃孵育过夜,商品化试剂盒检测REV阳性抗血清倍比稀释进行正交实验,确定了抗原的最佳包被浓度为4.24μg/mL,抗血清最佳稀释倍数为1：800倍；当抗原浓度为1.06μg/mL,抗血清稀释倍数为1：1600倍时,仍可检测到抗体阳性,显示其具有高敏感性；按照ELISA常规操作方法,固定其他反应条件,每次设一个条件作为变量对反应条件依次进行优化,结果显示最佳包被液为50mmol/L pH9.6碳酸盐缓冲液、最佳封闭液浓度为4%脱脂乳、最佳封闭时间为2h、抗血清孵育时间为1.5h、二抗稀释浓度为4000倍、二抗孵育时间为1h、显色时间为30min：通过对40份SPF鸡血清的检测,确定了其临界值(OD450nm0.340)；通过对4份阳性血清的检测,得出板内的变异系数为2.4%-10.1%,板间的变异系数为6.9%-11.3%,均小于15%,说明具有很好的重复性；通过对J亚群起那白血病病毒(ALV-J)、马立克氏病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(H5及H9)鸡常见病病毒的5种抗血清进行检测,结果显示无交叉反应,具有很高的特异性；本试剂盒与IDEXX试剂盒分别对186份临床样本进行检测,本试剂盒检测阳性率为51.08%,IDEXX试剂盒检测阳性率为48.92%,表明本试剂盒敏感性高于IDEXX试剂盒,两者匹配率为91.94%。用该试剂盒对山东省508只鸡进行了检测,检测品种包括蛋种鸡、商品蛋鸡、乌鸡和麻鸡,其阳性检出率分别为37.43%、6.52%和62.00%,平均阳性检出率为34.25%。检测到的所有品种都存在REV感染情况,说明REV感染在我省鸡群中普遍存在。本研究的完成为制备REV抗体ELISA检测试剂盒的国产化奠定了基础；为快速、准确诊断禽网状内皮组织增生症、保障我国禽业的健康持续发展提供技术支持。