本研究采用组织分离法、多孢分离法2种菌种分离方式进行蛹虫草菌种制备,采用甘油-琼脂半凝胶法、甘油-营养琼脂半凝胶法、斜面低温保藏法、鲜牛奶法共4种保藏方法进行菌种保藏。通过观察蛹虫草液体菌种、子实体形态,测定子实体产量及其生物活性成分虫草多糖、虫草酸含量,研究蛹虫草菌种分离及保藏方法对蛹虫草生长发育及生物活性成分积累的影响,结果表明:(1)组织分离法、多孢分离法均可成功制备蛹虫草菌种,组织分离法制备的菌种性状更稳定、品质更好。(2)蛹虫草子实体生长30d(天)时为组织分离法制备菌种的最佳分离时期,斜面低温保藏法为最佳保藏方法,在甘油-琼脂半凝胶中添加牛肉膏、蛋白胨等营养物质可在一定程度上延缓蛹虫草菌种品质的下降。该时期制备的菌种培养的液体菌出菌快、菌球匀实、数量多,液体菌培养的子实体转色快且深、长势健壮,出草率高,产量达20.71-21.86g/盒。(3)蛹虫草子实体生长40d时为多孢分离法制备菌种的最佳分离时期,斜面低温保藏法为最佳保藏方法,在甘油-琼脂半凝胶中添加牛肉膏、蛋白胨等营养物质对蛹虫草菌种品质下降的延缓作用不明显。该时期制备的菌种培养的液体菌较为理想,液体菌培养的蛹虫草较其它时期出草率高、畸形少、产量达20.44-20.64g/盒。(4)组织分离法制备的菌种培养的子实体虫草多糖、虫草酸含量变化小,分别为4.54-6.18%、0.203-0.381%,菌种保藏方法及分离时期对组织分离法制备的菌种培养的子实体的虫草多糖、虫草酸含量无显著影响。(5)多孢分离法制备的菌种培养的子实体虫草多糖、虫草酸含量变化较大,分别为3.54%-7.83%、0.066-0.448%,斜面低温保藏法保藏的菌种培养的子实体虫草多糖含量显著高于其它保藏方法,菌种保藏方法对多孢分离法制备的菌种培养的子实体的虫草多糖含量影响显著。