葡萄糖对芽孢杆菌属内互作影响的研究

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jianghui_one1
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微生物群落中含有很多物种,每个物种都会通过多种互作关系影响其他物种的生长与存活,进而影响微生物群落的结构与功能。芽孢杆菌属(Bacillus)作为自然界中分布广泛的细菌,由于其具有优良的抗逆、促生、生防等特性,常被进行多种组合发酵,用于菌剂、菌肥、生物肥的生产,但是目前我们仍对芽孢杆菌种间互作和影响因素还不清楚。因此,本文以同属芽孢杆菌构成的群落为研究对象,从沙漠贫瘠土壤中筛选五种不同的芽孢杆菌,通过16S r RNA、gyr B与基因组等分析,确定其分类地位;再将其共接种于唯一碳源为0.2%、0.4%和0.8%的葡萄糖的M9培养基中进行培养,应用绝对定量、基因组学、成对相互作用、“4+1”模式试验和转录组学技术,测定互作群落的菌种组成和比例,阐明不同种芽孢杆菌之间的互作关系,揭示葡萄糖浓度、互作关系、代谢相关基因介导的属内相互作用及其机理。主要结果如下:(1)首先,通过16S r RNA、gyr B基因测序和血琼脂检测筛选得到5种芽孢杆菌,再通过基因组分析确定了这五种芽孢杆菌属于不同菌种,分别为Bacillus subtilis(B.sub)、Bacillus licheniformis(B.lic)、Bacillus atrophaeus(B.atr)、Bacillus velezensis(B.vel)和Bacillus cereus(B.cer)。比较基因组结果表明,这五种芽孢杆菌含有的葡萄糖降解相关基因数量相近,而葡萄糖转运相关基因数量不同,其中B.vel和B.cer所含有的葡萄糖转运相关基因数量最少。(2)通过固体成对培养发现,当菌株之间的距离为0.5 cm时,不论葡萄糖浓度的高低,B.atr和B.sub都对B.cer的生长有明显的抑制,但当距离为1 cm时,无抑制现象,表明距离会影响芽孢杆菌之间的互作。通过液体成对培养发现,五种芽孢杆菌均以负相互作用为主,其中在低浓度葡萄糖中,五种菌之间的相互作用包含捕食(-/+、+/-)、拮抗(-/0、0/-)和竞争(-/-),而在中和高浓度葡萄糖培养中,只有拮抗(-/0、0/-)和竞争(-/-),可见低浓度葡萄糖培养中菌株之间的相互作用更复杂,表明随着葡萄糖浓度的增高,菌株之间出现更多的拮抗作用。(3)利用各芽孢杆菌的单拷贝特有基因对共培养后的菌株数量进行绝对定量,结果表明,在低浓度葡萄糖(0.2%)的M9培养基中,群落中B.atr、B.lic和B.sub的最终占比分别为43.43%、27.27%和29.29%,未检测到B.vel和B.cer。在中浓度葡萄糖(0.4%)的M9培养基中,群落中B.atr、B.lic和B.sub的最终占比分别为45%、28%和27%,未检测到B.vel和B.cer。在高葡萄糖浓度(0.8%)的M9培养基中,B.atr和B.lic的最终占比分别为58%和42%,其他三种菌未检测到。可以看出,低和中浓度葡萄糖的五种菌共培养结果相似,都有三种芽孢杆菌,但高葡萄糖浓度共培养最终仅存留两种芽孢杆菌,说明高葡萄糖浓度下细菌相互作用更加激烈。此外,不论葡萄糖浓度高低,B.vel和B.cer在共培养中的数量都随着转接次数而逐渐减小,表明其受到其他菌互作的影响最大。(4)利用各芽孢杆菌的单拷贝特有基因对“4+1”模式试验中的菌株数量进行绝对定量,再根据Bray-Curtis相异度比较单菌加入的前后对菌群组成之间的差异变化,从而探究每个物种的引入对其他4个物种互作的影响。结果发现,在低和中浓度葡萄糖培养下,B.sub对菌群的影响最大,在高葡萄糖浓度培养下,B.lic对菌群的影响最大。(5)通过对不同时间下高葡萄糖浓度共培养的转录组分析发现,随着培养时间的增加,B.atr在共培养中处于优势地位,而B.cer和B.sub则处于劣势地位。其中,在所有上调基因中,翻译以及翻译后修饰、核糖体结构和生物功能、碳水化合物转运代谢功能相关基因占比较多,在所有下调基因中,氨基酸转运代谢、转录、能量生成和转换功能相关基因占比较多,初步揭示了可能影响种间互作的基因。综上所述,本试验发现在以葡萄糖为唯一碳源培养中,菌株之间的距离会影响其成对互作的结果,且五种芽孢杆菌属内成对互作以负相互作用为主,在碳源贫瘠的情况下,属内成对互作更复杂,并且随着碳源浓度的升高,菌株间的互作越激烈且多以拮抗为主;五种芽孢杆菌共培养后,可利用碳源的浓度影响了最终菌群的组成与丰度,原因可能与基因组中含有的葡萄糖代谢相关基因数量有关系,而单一菌的引入也能影响其他四种菌形成的稳定群落的程度;同时转录组也阐明了五种菌在高浓度葡萄糖中参与互作的差异。本试验为研究同属细菌互作和菌株组合应用提供了一定的基础依据。
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