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研究背景据报道,在我国每年死于食管癌的人数约为21万人,男性人数多于女性,40岁以上的发病率高,它严重威胁着我国人民的健康和生命[1]。其治疗方法主要有手术切除、肿瘤的放疗和化疗等,单一的任何一种方法都不是理想的,因此多采用综合治疗,在手术切除后配合药物化疗。现在的化疗新药层出不穷,但因化疗产生的副反应仍然较大,并且耐药性不断增加,病人的的5年存活率依然很低。因此,利用我国的优势,研究中药及其提取的有效成分在肿瘤治疗方面的作用是以后发展的方向之一。本研究探讨了食管癌可能的发生机制及中药丹参中的挥发油-丹参酮ⅡA(TanⅡA)对人食管癌细胞株Eca-109的作用。TanⅡA是中药丹参的主要成分。丹参酮在临床上已被广泛应用于非肿瘤领域,主要用来治疗心血管疾病,在抗菌消炎等[1]方面也有显著疗效。近年来,学者对丹参酮IIA的抗肿瘤活性产生了极大兴趣,并进行了多种肿瘤细胞的体内外试验,但对食管癌的抗癌作用却鲜见报道。目的通过对人食管癌Eca-109细胞的培养,用不同浓度的TanⅡA干预其生长,运用现代分子生物学技术,探讨TanⅡA促进Eca-109细胞凋亡的机制,为TanⅡA更深入的研究做准备。方法1.MTT法:通过培养人食管癌Eca-109细胞,用不同剂量的TanⅡA作用于Eca-109细胞,通过四甲基偶氮唑盐法(MTT法)测定各组的吸光值(OD值),并计算出各组细胞的增殖抑制率,绘制增殖抑制率曲线。2.显微形态观察:药物组细胞和正常组细胞培养24小时后,在显微镜下观察正常细胞和药物干预细胞的生长状态和形态变化。3.细胞荧光观察:药物组细胞和正常组细胞培养24小时后,应用AO/EB染色,在荧光显微镜下观察两组细胞的形态变化。4.流式细胞术:采用140μg/ml、160μg/ml的TanⅡA干预细胞生长24和48小时,设置阴性对照,用流式检测细胞周期和细胞凋亡。5.免疫蛋白印迹法:采用140μg/ml、160μg/ml的TanⅡA干预细胞生长24小时,提取细胞的总蛋白,用BCA法进行蛋白定量,采用蛋白免疫印迹技术(western blot)检测Caspase-3、Caspase-9、Cyclin A和CDK2的表达,以β-actin作为内参,用BIO-RAD软件分析条带的灰度值。结果1.MTT检测结果显示:正常组细胞活力明显高于药物组,并且在一定的范围内,随药物的浓度增加,细胞的活力下降,最高的抑制率可达66.164%,与阴性对照组相比较,差异有统计学意义(P﹤0.05)。2.显微镜观察显示:经过TanⅡA处理后的细胞与正常组细胞相比较,药物组细胞有明显的凋亡形态的改变,出现细胞漂浮,细胞核固缩,细胞膜结构破坏出现“小泡”现象。3.细胞荧光观察结果显示:与正常组细胞相比较,药物组细胞出现核染色质着绿色或红色并呈固缩状、圆珠状。4.流式结果表明:1)140μg/ml TanⅡA干预Eca-109细胞24小时后,结果显示S期的细胞数升高,达到54.47%;同时G0/G1期的细胞数下降,由51.317%降至41.787%,与阴性对照相比,差异具有统计学意义(P﹤0.05)。2)采用140μg/ml和160μg/ml的TanⅡA培养细胞24小时,结果显示药物组凋亡指数随着药物浓度的增加,凋亡指数增大,由阴性的8.319增加到TanⅡA140、160μg/ml组的31.982和52.937。用药组和阴性对照组相比较,差异具有统计学意义(P﹤0.01)。5.Western blot结果显示:药物培养24小时后,细胞内Cyclin A、CDK2表达量降低;Caspase-3、Caspase-9的表达量上升,和正常组相比较,差异具有统计学意义(P﹤0.05)。结论1.TanⅡA可以抑制人食管癌细胞的增殖活力,并且这种抑制作用随药物浓度的增加会更明显。2.在TanⅡA作用于食管癌细胞系Eca-109的过程中,随着药物浓度的升高,细胞在S期的比例逐渐升高,S期检查点的调控因子Cyclin A和CDK2的相对表达量降低。3.TanⅡA抑制人食管癌Eca-109细胞的增殖并促进其凋亡的机制可能与通过下调Cyclin A和CDK2,将细胞阻滞于S期和上调Caspase-9和Caspase-3促进细胞凋亡增加有关。