暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela Motschulsky),属于鞘翅目鳃金龟科,幼虫称为蛴螬,是一种危害严重的地下害虫。近几年地下害虫危害程度日渐严重,其防治已成为亟待解决的问题。随着人们对自身健康和食品安全日益关注,性诱剂和植物源诱剂作为环保、低毒、安全和高效的防治手段得到越来越多的重视。因此,筛选对暗黑鳃金龟有诱集活性的植物挥发物,开展害虫的食诱剂防治具有重要意义。嗅觉系统和味觉系统是昆虫识别植物挥发物和性信息素的主要途径。但是暗黑鳃金龟如何识别和代谢气味分子的机理仍不清楚,深入研究暗黑鳃金龟的嗅觉分子识别机制,筛选参与嗅觉识别过程的相关蛋白,比较雌雄触角感器、对植物挥发物偏好性、代谢通路及嗅觉蛋白的差异,将有助于发掘更具潜力的害虫靶标基因,研究结果如下:(1)为了深入探讨雌雄暗黑鳃金龟触角嗅觉感器的差异,利用电子显微镜技术对触角的超微结构进行了解析。扫描电镜观察发现暗黑鳃金龟的触角是典型的鳃叶形结构,包括柄节、梗节和鞭节,鞭节最后三节特化为片层状的鳃叶部。共发现了二十二种感器类型:包括三种毛形感器(TRS)、三种刺形感器(CHS)、四种板形感器(PLAS)、两种腔锥形感器(COS)、六种耳形感器(AUS),Bohm氏鬃毛(BB)和三种锥形感器(BAS)。TRS、CHS和Bohm氏鬃毛主要分布在触角的外表面,推测主要作为机械感受器;PLAS、COS、AUS和BAS则集中分布在鳃叶部片层内,推测主要是作为化学感受器。鳃叶部感器的数量和分布分析表明:鳃叶部PLAS的数量约为COS和AUS总和,推测PLAS识别多样化气味分子中发挥作用;从分布位置上分析,PLAS主要分布在片层的边缘,而COS、BAS和AUS则散布在片层中心。从雌雄差异分析,雄性的PLAS和BAS数量高于雌性,但雌性的COS和AUS数量较高,雌雄触角数量和类型的差异显示感器功能的不同。(2)通过行为学分析暗黑鳃金龟雌雄触角对植物挥发物的选择偏好性。通过EAG电生理实验测定了 1 1种植物挥发物对暗黑鳃金龟的触角电位反应,结果发现苯乙醛、顺-3-己烯醇能分别引起雄虫和雌虫较高触角电位反应。而且雌雄虫触角对植物挥发物的敏感性存在雌雄差异,雌虫对丙酸苯乙酯和香叶醇敏感,雄虫对苯乙醛、反-2-己烯醇和丁子香酚反应强烈。通过EAG浓度梯度实验比较分析了这些挥发物引起EAG反应的最适浓度。对于雌虫,顺-3-己烯醇在10μg/μl,反-2-己烯醛在0.1μg/μl,顺-3-己烯酯在1μg/μl浓度时能引起最佳的触角电位反应。对于雄虫,反-2-己烯醇在低浓度0.1μg/μl就达到最强的触角电位,而苯乙醛在浓度1μg/μl时触角电位达到平台期。利用“Y”型管测试雌雄暗黑鳃金龟对11挥发物的行为反应,发现雄虫对苯乙醛等显示出较高的偏好性,雌虫对顺-3-己烯酯等有较强的偏好性。通过罩笼实验测试苯乙醛对性信息素诱集作用的增效效果,随着苯乙醛浓度的增加,性信息素的诱集效果明显提高,以1:3比率诱集效果最佳。(3)在构建暗黑鳃金龟触角转录组数据库的基础上,利用生物信息学方法,对雌虫和雄虫触角转录组数据进行了系统的分析。研究结果显示:雌虫触角经过组装最终得到43624个unigenes,雄虫触角得到38785个unigenes,混合拼接组装得到 34706 个不同的 unigenes。通过 Nr、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO数据库分析,共有19025个基因得到注释。通过GO和COG功能注释分析了暗黑鳃金龟雌雄触角参与的主要生理过程。通过KEGG注释共获得了4172 个 KEGG Orthology(KO),378 个 KEGG 代谢通路和 248 个 KEGG 模块,信号转导(signal transduction)是触角中最主要代谢通路。进一步通过比较雌雄触角转录组得到1870个差异表达基因,其中,158个基因在雄虫触角中上调表达,1712个基因在雌虫触角上调表达。53个雄虫上调表达基因和432个雌虫上调表达基因获得GO功能注释。393个雌性上调和40个雄性上调表达的差异基因获得KEGG代谢通路注释,进一步180个雌性和38个雄性差异基因分配到KEGG代谢通路(KEGG pathway),20个雌性和9个雄性差异基因分配到“KEGG模块”(KEGG module)。差异表达基因主要富集在物质调控、代谢和信号转导等相关的通路。(4)雌雄触角转录组测序一共鉴定出145个化学感受相关基因,包括7个OBPs,3 个 CSPs,2 个 SNMPs,47 个 ORs,15 个 GRs,27 个 IRs,43 个细胞色素P450s和1个NADPH-细胞色素P450还原酶。差异转录组分析鉴定出2个细胞色素P450基因在雌虫触角显著上调表达。(5)对暗黑鳃金龟转录组新鉴定出的化学感受基因进行生物信息学分析和组织表达分析,明确这些嗅觉基因的特征和表达谱,预测其潜在的嗅觉功能。分析7个OBP和3个CSP基因得到了保守的4个或6个半胱氨酸残基位点和6个α螺旋的位置。通过motif分析得到鞘翅目OBP和CSP中的8个保守motif区域,这些motif分别在OBP和CSP中构成1 1个和2个常见的motif组合模式,暗示OBP和CSP的不同功能特性。系统发育分析推断OBP和CSP与其他物种的亲缘关系及蛋白功能。利用FPKM值和qRT-PCR 比较OBP和CSP在雌雄触角间的表达量差异并预测在雌雄触角的功能差异:5个OBP(HparOBP33,34,35,36和37)和1个CSP(HparCSP17)在雌性触角中显示有更高的表达量。利用荧光定量PCR实验比较OBP和CSP在嗅觉组织和其他非嗅觉组织间的表达量差异,鉴定触角特异性表达或偏好性表达的嗅觉相关基因(HparOBP36、HparOBP37和HparCSP17),这些基因可能在触角中执行重要的嗅觉功能。其他非嗅觉特异性的基因(HparOBP35)参与到其他的生理进程。(6)化学感受基因包括嗅觉和味觉基因,嗅觉基因参与嗅觉系统(如ORs),味觉基因参与味觉系统(如GRs)。潜在的化学感受受体基因也被鉴定出来:包括47个ORs、15个GRs和27个IRs以及2个感觉神经元膜蛋白(SNMPs)。26个ORs、4个GRs、16个IRs和2个SNMPs有完整的开放阅读框,预测出ORs的7个跨膜结构域和SNMPs的2个跨膜结构域。系统发育分析展示了化学感受受体基因与其他物种的相关性,包括OR共表达受体(HparOR40)、IR共表达受体(HparIR1和HparIR27)、二氧化碳受体(HparGR5和HparGR14)和糖受体(HparGR8、HparGR11和HparGR13)等。13个受体基因在雌性触角中表达高于雄性触角,而4个受体基因在雄性触角中表达高于雌性触角;12个受体基因主要在嗅觉器官触角中显著表达,而非嗅觉组织中表达水平较低。2个SNMP在雌性触角中表现出高度的雌性偏好性和触角偏好性表达情况。(7)鉴定出43个细胞色素P450s和1个NADPH-细胞色素P450还原酶。通过生物信息学分析,成功预测P450基因保守的底物识别位点(SRS1-6)、’EXXR’和’WXXXR’基序、PERF和heme结合域以及CPR三个保守的区域,FMN,FAD and NADPH结合区域和活性催化残基(丝氨酸472,半胱氨酸644,天冬氨酸687和色氨酸689)。系统发育分析发现22个CYP3家族基因(CYP6亚族16个基因,CYP345亚族4个以及CYP9亚族2个),20个CYP4家族基因(CYP4亚族16个以及CYP313亚族4个)和1个CYP2家族基因(聚在CYP303亚族)。差异转录组数据表明HparCYP8和HparCYP33在雌虫触角中显著上调表达。qRT-PCR实验发现23个和10个分别在雄虫和雌虫触角显著高表达的P450基因。此外,也鉴定出4个雌雄触角特异性表达基因(HparCYP7,9,15和36)和4个触角偏好性表达基因(HparCYP3,18,34和35)。