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在我国悠久的食用和药用历史中,黑灵芝(Ganoderma Lucidum)一直有着较引人注目的地位,甾醇类化合物是灵芝中含量较高且功能活性丰富的成分之一。近年来,植物甾醇的降胆固醇作用引起了广泛的关注,对其降胆固醇效应的机制也成为了一个研究的热点。有研究表明,甾醇类化合物的降胆固醇活性与其结构息息相关。然而目前对菌类中甾醇类化合物改善机体胆固醇水平的研究一般只停留在对表象的描述阶段,不能反映其影响胆固醇代谢的状态,对于其作用机制的研究也相对较少。因此,本课题拟通过构建HepG2细胞胆固醇代谢模型和Caco-2细胞吸收转运模型探究体外细胞中胆固醇的吸收和代谢,探明4种黑灵芝来源的甾醇类化合物(麦角甾醇、麦角甾醇酯、(22E)-麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3酮和麦角甾-7,22-二烯-3β-醇)直接作用对胆固醇吸收和代谢的影响及作用机制及其构效关系,并分析灵芝中甾醇类化合物对体外细胞内胆固醇吸收转运的调控机理,提出黑灵芝中甾醇类化合物直接调节胆固醇代谢的信号转导途径,并采用代谢组学技术研究灵芝中甾醇类化合物调节胆固醇代谢的作用机制。主要结果如下:1.构建HepG2高胆固醇细胞模型探究黑灵芝来源的甾醇类化合物对HepG2细胞胆固醇代谢的影响。结果表明:四种甾醇类化合物(25,50和100 μM)可降低高胆固醇模型中的细胞总胆固醇和甘油三酯,并且能改善由25-羟胆固醇和胆固醇的添加带来的脂质的增加和紊乱。此外,甾醇类化合物通过降低胆固醇的吸收(下调NPC1L1的表达),促进胆固醇向肠道的排泄(上调ABCG5和ABCG8),同时降低胆固醇的在肝脏的生物合成(下调HMGCS1和SREBP2)和影响胆固醇在肝脏中向胆固醇酯转化后进入血液循环(下调ACAT2)。进一步对甾醇类化合物的构效关系进行探讨发现(1)麦角甾醇在大多数情况下(NPC1L1表达除外)降胆固醇效果强于麦角甾醇酯,这表明它们的降低胆固醇的活性可能与甾醇类化合物C3的官能团(羟基或酯)相关。(2)麦角甾醇的降胆固醇活性显著强于(22E)-麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3酮,但是要明确带来这一差异的具体结构关联,需要进一步的实验探索。(3)麦角甾醇(C5上有一个双键)降胆固醇效果高于星鱼甾醇(C5上没有双键),这表明它们的降低胆固醇的活性也与植物甾醇的C5位置的双键相关。2.运用Transwell模型研究黑灵芝来源的甾醇类化合物对Caco-2细胞胆固醇吸收转运的影响。结果表明:四种甾醇类化合物(25,50和100μM)可改善高胆固醇对Caco-2细胞单层完整性和紧密性带来的影响并降低Transwell高胆固醇模型中的细胞胆固醇吸收。同时,甾醇类化合物通过降低胆固醇的吸收(下调NPC1L1的表达),促进胆固醇向肠道的排泄(上调ABCG5和ABCG8),同时降低胆固醇调节蛋白的活性(下调SREBP2)和影响胆固醇在肝脏中向胆固醇酯转化后进入血液循环(下调ACAT2)。进一步对甾醇类化合物构效关系进行探讨发现(1)麦角甾醇降胆固醇效果的各个指标与麦角甾醇酯比较结果不一致,这表明它们的降低胆固醇的活性可能与甾醇类化合物C3的官能团(羟基或酯)相关,但需要进一步探索和研究。(2)麦角甾醇的降胆固醇活性显著强于(22E)-麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3酮,但是要明确带来这一差异的具体结构关联,需要进一步的实验探索。(3)麦角甾醇(C5上有一个双键)降胆固醇效果与星鱼甾醇(C5上没有双键)比较也没有一致的结果。3.利用GC-MS代谢组学技术筛选各实验组的差异代谢物结果显示,有14种代谢差异物,包括:乳酸草酸、柠檬酸、棕榈酸、琥珀酸、苹果酸、油酸、硬脂酸、丙氨酸、β-丙氨酸、甘油和肌醇、L5氧脯氨酸和甘氨酸。从代谢差异物上看,麦角甾醇、麦角甾醇酯、(22E)-麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3酮和星鱼甾醇主要通过6条代谢路径来干预细胞血脂代谢,分别是:糖酵解路径、TCA循环、丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢、脯氨酸代谢和胆汁酸代谢。胆固醇的添加可以刺激细胞能量代谢,导致细胞TCA循环和氨基酸循环发生一定的紊乱,阳性药物Ezetimibe可以改善TCA循环紊乱,但是对于能量代谢和氨基酸代谢紊乱没有明显效果。四种甾醇化合物中,只有星鱼甾醇对于细胞能量代谢紊乱有一定的改善作用;麦角甾醇、麦角甾醇酯和星鱼甾醇都能改善细胞的TCA循环紊乱;对于氨基酸代谢紊乱都没有效果。可以得出所选四种甾醇化合物主要是通过影响细胞TCA循环过程来影响脂质代谢,四种甾醇化合物中的(22E)-麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3酮对于细胞的脂质代谢紊乱没有改善作用。